用白花前胡戊素联合氨茶碱对哮喘小鼠进行治疗对其肺组织中NF-κB和IL-6水平的影响

甘连芳，钟立璠，黄 凌

（海南医学院，海南 海口 571199）

哮喘是一种涉及多种炎症细胞相互作用、多种细胞因子参与的慢性气道炎性疾病[1]。有研究指出，哮喘的发生与患者存在核转录因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等细胞因子表达水平的异常增高密切相关[2]。氨茶碱具有良好的平喘作用。用此药治疗哮喘可显著改善患者的肺功能，缓解其气道的炎症反应[3-4]。白花前胡具有镇咳、化痰、平喘的功效。此药是目前临床上常用的各种镇咳平喘中成药的主要有效成分之一[5]。白花前胡戊素（Praeruptorin E，PE）是白花前胡的主要活性成分。药理学研究表明，PE可抑制炎症反应发生时NF-κB的转位及激活，降低IL-6的水平，减轻炎症反应[6]。本文主要是观察用PE联合氨茶碱对卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致哮喘小鼠进行治疗对其肺组织中NF-κB和IL-6水平的影响。

1 材料及方法

1.1 实验材料

PE（上海源叶生物技术有限公司生产）；OVA（Sigma公司生产）；Al(OH)3（Thermo公司生产）；兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗体（Cell Signaling Technology,Inc生产）；二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司生产）；苏木精、伊红（Sigma公司生产）；TransZol、总RNA快速提取试剂盒（Generay公司生产）；逆转录试剂盒（Biosharp公司生产）；qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen公司生产）。

1.2 实验动物分组及处理

将36只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为空白组、OVA组、氨茶碱组、氨茶碱+PE小剂量组、氨茶碱+PE中剂量组和氨茶碱+PE大剂量组，每组6只小鼠。对除空白组小鼠外的其余各组小鼠进行哮喘造模，为其腹腔注射OVA致敏溶液〔含有OVA和Al(OH)3〕，0.2 mL/次，1次/d，连续注射7 d。之后使用2%的OVA激发溶液对其进行雾化吸入激发处理，30 min/次，1次/d，连续吸入7 d。在对这些小鼠进行造模的同时，为空白组小鼠使用等剂量的生理盐水。完成上述造模处理后，为氨茶碱组小鼠使用氨茶碱（每次30 mg/kg）进行灌胃处理，1次/d。为氨茶碱+PE小剂量组小鼠使用氨茶碱（每次30 mg/kg）和小剂量的PE（每次2.5 mg/kg）进行灌胃处理，1次/d。为氨茶碱+PE中剂量组小鼠使用氨茶碱（每次30 mg/kg）和中剂量的PE（每次10 mg/kg）进行灌胃处理，1次/d。为氨茶碱+PE大剂量组小鼠使用氨茶碱（每次30 mg/kg）和大剂量的PE（每次40 mg/kg）进行灌胃处理，1次/d。各组小鼠均连续灌胃7 d，然后对其进行剖检。

1.3 对各组小鼠进行病理切片检查

对各组小鼠的肺组织进行常规石蜡包埋、切片处理，采用苏木精-伊红染色法对切片进行染色，在400倍的显微镜下观察切片中肺组织的结构形态。

1.4 采用免疫组化法检测各组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的表达

将各组小鼠的肺组织浸泡在4%的中性甲醛溶液中固定72 h，然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、封闭处理。在切片中加入兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗体孵育过夜，然后进行显色、封片处理。观察切片中的NF-κBp65蛋白，用专业的图像分析软件计算各组小鼠肺组织中NFκBp65蛋白的阳性表达率。

1.5 采用聚合酶链式反应法检测各组小鼠肺组织中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表达

提取各组小鼠肺组织中的总RNA，使用微量核酸检测仪测定RNA的纯度和浓度，取合格的总RNA样品进行cDNA的逆转录合成，并置于聚合酶链式反应分析仪中进行扩增处理。引物设计如 下：NF-κBp65 F：5’-AGGATTTCGATTCCGCTACG-3’，R：5’-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3’；IL-6 F:5'-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3'，R：5’-TACATTGCCGAAGAGCC-3’；Actin F：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，R：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。循环结束后，绘制溶解曲线。获得NF-κBp65、IL-6和Actin的荧光域值循环数(Ct值)后，计算NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平。

1.6 统计学处理

采用SPSS 25.0软件对本研究中的数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 接受相应处理后各组小鼠肺组织的结构形态

接受相应处理后，各组小鼠肺组织的结构形态如下：1）空白组小鼠：小鼠支气管周围细胞核和细胞质的形态正常，无形态学改变，结构清晰；2）OVA组小鼠：小鼠支气管壁周围出现明显的炎性细胞浸润，其支气管壁明显增厚；3）氨茶碱组小鼠：小鼠支气管壁周围出现轻微的炎性细胞浸润，其支气管壁轻微增厚；4）氨茶碱+PE小剂量组小鼠：小鼠支气管壁周围出现轻微的炎性细胞浸润，其支气管壁结构几乎无改变；5）氨茶碱+PE中剂量组小鼠：小鼠支气管壁周围出现轻微的炎性细胞浸润，其支气管壁结构无改变；6）氨茶碱+PE大剂量组小鼠：小鼠支气管壁周围无炎性细胞浸润，其支气管壁结构无改变。详见图1。

图1 接受相应处理后各组小鼠肺组织的结构形态

2.2 各组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的表达情况

与空白组小鼠相比，OVA组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率较高，P＜0.05。与OVA组小鼠相比，氨茶碱组小鼠接受治疗后其肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率较低，P＜0.05。接受治疗后，氨茶碱+PE小剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率低于氨茶碱组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE中剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率低于氨茶碱+PE小剂量组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE大剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率低于氨茶碱+PE中剂量组小鼠，P＜0.05。详见图2。

图2 各组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的表达情况

2.3 各组小鼠肺组织中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表达情况

与空白组小鼠相比，OVA组小鼠肺组织中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均较高，P＜0.05。与OVA组小鼠相比，氨茶碱组小鼠接受治疗后其肺组织中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均较低，P＜0.05。接受治疗后，氨茶碱+PE小剂量组小鼠肺组织中NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE中剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱+PE小剂量组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE大剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱+PE中剂量组小鼠，P＜0.05。详见图3。

图3 各组小鼠肺组织中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达情况

3 讨论

PE是白花前胡的主要活性成分，具有良好的抗炎作用[6]。药理学研究表明，PE可抑制NF-κB的核转运，从而可起到减轻炎症反应的作用[7-8]。本研究的结果显示，接受治疗后，氨茶碱+PE小剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE中剂量组小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的阳性表达率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱+PE小剂量组小鼠，P＜0.05；氨茶碱+PE大剂量组小鼠肺组织中NFκBp65蛋白的阳性表达率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表达水平均低于氨茶碱+PE中剂量组小鼠，P＜0.05。这与相关研究的结果相符[9-10]。这表明，与单用氨茶碱、用小剂量的PE联合氨茶碱、用中剂量的PE联合氨茶碱相比，用大剂量的PE联合氨茶碱对OVA致哮喘小鼠进行治疗的效果较好，可显著降低其肺组织中NF-κB和IL-6的表达水平，减轻其气道的炎症反应。