利拉鲁肽对胰岛素抵抗大鼠肝脏GRP78-JNK-GLUT2通路的影响

郭晓宇 高 宇 宋 娜 山秀杰 葛晓春 冯增斌 刘晓燕

(承德医学院附属医院内分泌科，河北 承德 067000)

胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)及代谢综合征发病共同病理生理基础，肝脏是胰岛素作用主要靶器官之一，更是胰岛素调节机体糖、脂代谢的重要效应器官。胰高血糖素样肽(GLP)-1类似物利拉鲁肽是目前治疗T2DM的新型降糖药物，最新研究发现利拉鲁肽还可显著减轻T2DM大鼠肝脏IR〔1〕。持续的内质网应激(ERS)发生在胰岛素作用的主要靶组织(肝脏、脂肪、肌肉等)可引起IR，但具体机制不明〔2〕。本实验通过观察高脂喂养大鼠肝脏ERS相关分子葡萄糖调节蛋白(GRP)78、c-jun氨基末端激酶(JNK)及胰岛素受体相关因子蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖转运子(GLUT)2表达的影响，探讨不同浓度利拉鲁肽利拉鲁肽对肝脏ERS及IR的干预效应。

1 材料与方法

1.1实验材料 游离脂肪酸测定盒及三酰甘油(TG)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。TRIzol 购自美国Invitrogen公司，引物合成于Invitrogen上海贸易有限公司，cDNA反转录试剂盒及荧光定量试剂盒均购自天根生化科技有限公司，AKT抗体购自SANTA CRUZ公司，其余抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。利拉鲁肽购自丹麦诺和诺德公司。

1.2实验动物 4月龄健康Wistar雄性大鼠54只，体重250 g左右，购自北京维通利〔合格证号：SCXK(京)2012-0001〕，实验期间室内温度(22±2)℃，相对湿度(50±5)%，每 12 h光照/黑暗循环 (光照时间7∶00～19∶00)，自由饮水、进食。

1.3方法

1.3.1动物分组及模型制备 大鼠适应性喂养3 d后，随机分为对照(NC)组16只与高脂喂养组38只，普通饲料及高脂饲料购自北京科奥协力有限公司。普通饲料热量组成：碳水化合物64.19%，脂肪12.04%，蛋白质23.77%，总热量为337 kCal/100 g。高脂饲料热量组成：碳水化合物30.01%，脂肪53.75%，蛋白质16.24%，总热量为486 kCal/100 g。喂养8 w末行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验〔2〕，计算葡萄糖输注率(GIR)，确定高脂喂养大鼠IR状态是否造模成功。

1.3.2给药方案 成膜后将高脂饲养组随机分为高脂组(HFD组，高脂饮食+生理盐水皮下注射)；利拉鲁肽低剂量组(LL组，高脂饮食+100 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽皮下注射)；利拉鲁肽高剂量组(HL组，高脂饮食+200 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽皮下注射)；NC组给予0.5 ml生理盐水皮下注射。药物干预2 w后，各组取5只大鼠再行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验。

1.3.3血清生化指标检测及肝组织苏木素-伊红(HE)染色 采用全自动生化仪测定TG、丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)。取肝组织，行HE染色观察其病理学改变。

1.3.4血清游离脂肪酸(FFA)及肝脏内TG(LTG)检测 按照相应酶联免疫吸附法(ELASIA)试剂盒说明书方法(购自南京建成生物工程研究所)。

1.3.5口服葡萄糖耐量试验(OGTT)实验 药物干预2 w后，4组大鼠随机各取5只进行实验。取尾部一滴血，测空腹血糖。大鼠灌糖后，测30、60、120 min血糖。计算大鼠葡萄糖曲线下面积(AUC)，公式为AUC= (0′+30′)/4+(30′+60′)/4+(60′+120′)/2。

1.3.6Western印迹检测肝脏组织相关蛋白表达量 取适量肝组织液氮下研磨成粉末，加入组织裂解液，冰上匀浆后4℃ 14 000 r/min离心30 min，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。配备12%分离胶和4%浓缩胶。转膜后用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，分别加入一抗兔抗鼠GRP78、JNK、JNK磷酸化(P-JNK)、AKT、AKT磷酸化(P-AKT)、GLUT2，按4℃孵育过夜，次日室温用辣根过氧化物酶标记二抗羊抗兔孵育2 h，TBST洗膜后进行曝光显影。利用图像分析软件Image J对显影条带进行灰度值进行定量分析。用“目的蛋白灰度值/内参灰度值”代表目的蛋白的相对表达量情况。

1.3.7总RNA提取和荧光定量PCR检测肝脏相关基因的表达 应用Trizol试剂提取各组大鼠肝脏总 RNA。以β-actin作为内参。每个循环 94℃，变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸 15 s。利用检测到的荧光信号，得到每份标本的扩增曲线及熔点曲线，检测反应的特异性，得到各自的Ct值，每组均重复3次。GRP78引物序列：上游引物5′-AACCCAGATGAGGCTGTAGCA-3′，下游引物5′-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3′，产物长度约158 bp。GLUT-2引物序列：上游产物5′-GGCCTCTGTGGAAAATGTCTC-3′，下游产物5′-AGGGTACATGGTGGTGCC GCCGAGA-3′，产物长度约176 bp。β-actin引物序列：上游产物5′-TGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游产物5′-TGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA-3′，产物长度约138 bp。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件进行LSD-t检验、方差分析及直线相关分析。

2 结 果

2.1一般项目结果 与NC组相比，HFD、LL、HL组的体重、血FFA(除HL组)、TG、LTG、AST、ALT均显著升高(P<0.05)；与HFD组相比，HL组的体重、血FFA、TG、LTG、AST、ALT均明显下降(P<0.05)。与HFD组相比，LL组仅FFA、AST、ALT明显下降(P<0.05)。与LL组相比，HL组体重、FFA、LTG、TG、AST、ALT均明显减少(P<0.05)。见表1。

表1 四组大鼠一般资料的比较

与NC组相比：1)P<0.05；与HFD组相比：2)P<0.05；与LL组相比：3)P<0.05，下表同

2.2光镜观察大鼠肝细胞形态学变化 NC组肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，中央静脉大而壁薄，肝细胞索在中央静脉周围呈放射状分布，HFD组肝细胞体积明显增大，胞质内可见大小不一的脂滴空泡，胞核被推向周边，LL组肝细胞体积有所减小，胞质内脂滴空泡明显减少，HL组肝小叶和肝窦结构清晰，细胞排列整齐，细胞仅可见少许脂滴空泡。见图1。

2.3OGTT结果 与NC组比较，HFD组大鼠各时间点血糖均明显升高、AUC明显增加(P<0.05)；与HFD组比较，HL组各点血糖和AUC均明显下降(P<0.05)，LL组各时间点血糖与AUC下降，但仅120 min血糖差异有统计学意义(P<0.05)；与LL组比较，HL组0 min、120 min血糖和AUC明显下降(P<0.05)，见表2。

图1 各组大鼠肝脏形态学变化情况(HE，×200)

组别血糖(mmol/L)0 min30 min60 min120 minAUCNC组5.26±0.316.14±0.817.48±1.005.51±0.2813.44±1.06HFD组7.04±0.511)10.38±1.681)10.84±1.201)7.84±0.341)18.95±1.391)LL组6.36±0.369.14±0.748.84±0.826.63±0.802)16.21±0.65HL组5.73±0.762)3)8.91±0.872)8.66±0.752)6.23±0.682)3)14.77±0.552)3)

2.4Western印迹法检测大鼠肝脏相关蛋白表达情况 与NC组相比，HFD组GRP78、P-JNK/JNK蛋白表达显著升高，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表达显著减少(P<0.05)。与HFD组相比，HL组、LL组 GRP78、P-JNK/JNK蛋白表达均下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表达均增加(P<0.05)。与LL组相比，HL组GRP78、p-JNK/JNK蛋白表达下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表达增加(P<0.05)。如图2、图3，表3。

图2 GRP78、GLUT2蛋白表达情况

图3 JNK、AKT磷酸化情况

组别GRP78GLUT2P-JNK/JNKP-AKT/AKTNC组0.54±0.021.03±0.020.86±0.081.69±0.01HFD组1.24±0.081)0.21±0.011)1.67±0.071)1.08±0.021)LL组0.97±0.031)2)0.54±0.021)2)1.15±0.071)2)1.35±0.011)2)HL组0.62±0.051)2)3)0.82±0.021)2)3)0.96±0.011)2)3)1.55±0.021)2)3)

2.5Real-Time RCR 法检测大鼠肝脏GRP78、GLUT2 mRNA表达情况 与NC组大鼠相比，HFD组大鼠的GRP78 mRNA的表达显著增高，GLUT2 mRNA表达显著减低(P<0.05)；与HFD组大鼠相比，LL组及HL组大鼠GRP78 mRNA的表达均显著降低(P<0.05)，与LL组大鼠相比，HL组减低更为明显(P<0.05)；与HFD组大鼠相比，LL组及HL组GLUT2 mRNA的表达均显著上调(P<0.05)，但HL组上调程度显著高于LL组(P<0.05)。见表4。

2.6单因素相关分析 GIR与体重、FFA、LTG、TG呈负相关(P<0.05,P<0.01)。GRP78蛋白表达量与FFA、LTG、TG呈正相关，与GIR呈负相关(P<0.05,P<0.01)。GLUT2蛋白表达量与FFA、LTG、TG呈负相关，与GIR呈正相关(P<0.01)，见表5。

表4 4组大鼠肝脏GRP78、GLUT2 mRNA表达情况

表5 大鼠GIR及肝脏GRP78、P-JNK、P-AKT、GLUT2蛋白相关分析

3 讨 论

ERS与肥胖、IR和T2DM等的发病环节密切相关〔3〕。GRP78是ERS反应标志性分子伴侣，蛋白激酶样内质网激酶(PEPK)，转录激活因子(ATF)6，和肌醇激酶(IRE)1α与GRP78在内质网膜上相结合，以保持其非活动状态，当错误折叠的蛋白质在ER腔中积聚时，分子伴侣GRP78与以上三个受体解离，以促进未折叠或错误折叠的蛋白进行正确折叠。本研究证实高脂喂养大鼠肝脏发生了ERS，伴有GIR下降，出现IR，与既往研究结果肝脏发生ERS时促进机体IR的加剧相符合〔4〕。ERS激活IRE-1α，继而引起JNK信号通路活化〔5〕，活化后JNK使胰岛素刺激的P-AKT和胰岛素受体底物(IRS)-1酪氨酸磷酸化受到抑制阻止了胰岛素信号的传导，降低了胰岛素在外周组织的敏感性，导致IR的发生〔6，7〕。利拉鲁肽是目前研发的GLP-1类似物，不仅可以改善胰岛B细胞功能促进胰岛素分泌发挥降糖作用，还可显著减轻T2DM大鼠IR〔8〕。本研究说明利拉鲁肽有改善IR发挥降糖作用，与既往Díaz-Soto等〔9〕研究一致。本实验提示IR减轻与ERS缓解相关。利拉鲁肽呈浓度依赖性改善大鼠ERS，减轻IR。有研究发现，GLP-1类似物可刺激糖尿病大鼠肝脏、肌肉及脂肪组织GLUT2、GLUT4蛋白及mRNA的表达，从而增加机体对胰岛素的敏感性〔10〕。利拉鲁肽是否通过降低FFA和肝内脂质沉积，影响内质网GRP78-JNK-AKT-GLUT2通路，改善ERS，减轻肝脏IR，目前尚未报道。综上，高脂饮食可导致FFA及肝内脂质蓄积，发生ERS，导致IR，利拉鲁肽可呈依赖性缓解高脂喂养大鼠肝脏内质网应激，减轻IR，其机制可能与利拉鲁肽使肝细胞内质网应激分子伴侣GRP78蛋白表达水平下降及JNK-AKT-GLUT2通路有关，然而其具体的分子机制还待进一步研究。