星蒌承气汤加味对脑出血大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α表达及神经功能的影响

赵晓君 吴晓光 徐 樱 王建福

(承德医学院研究生院，河北 承德 067000)

脑出血后红细胞裂解、凝血酶、氧化应激等因素引起的炎症反应是导致脑出血后脑水肿的主要原因〔1～3〕，对脑出血患者的预后及康复起着重要的作用。本课题组临床应用星蒌承气汤加味在治疗急性脑出血，抑制脑水肿等方面取得很好的疗效，但其机制尚不明确。本研究探讨星蒌承气汤加味脑出血大鼠血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17A、肿瘤坏死因子(TNF)-α等表达及神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级成年雄性SD大鼠70只，3～4月龄，体质量300～360 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号：scxk(京)2014-0004。主要药物和试剂：大鼠IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒(上海联硕生物科技有限公司，批号：201612)，中药星蒌承气汤加味(承德市中医院，批号：17030112)，加水煎煮并浓缩至含药量为2 g/ml，4℃保存备用。

1.2动物模型制作 随机选取雄性SD大鼠54只，均采用基底节注入自体动脉血的方法制作脑出血动物模型〔4〕。4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠固定于脑立体定位仪上，颅顶中线切口，剥离骨膜，暴露前囟，在前囟前0.2 mm、中线右侧3.5 mm处钻一直径约1.0 mm的小孔，自体尾动脉抽取适量血液，在钻孔处用微量注射器垂直进针6 mm(此处为脑右侧基底节区)，缓慢注入80 μl动脉血，注射完毕后留针10 min后缓慢拔针，碘伏消毒，缝合皮肤。剩余16只大鼠作为假手术组在造模过程中不注入动脉血，其余操作同模型组。

1.3动物分组、神经功能评分及给药 造模动物在自然苏醒后参照Longa 5级4分法进行神经功能评分〔5〕，取1～3分者入实验。将符合要求的48只大鼠随机等分为模型组、星蒌承气汤加味高剂量组(高剂量组)、星蒌承气汤加味低剂量组(低剂量组)。大鼠神经功能评分结束后，高剂量组给予中药50 g·kg-1·d-1灌胃，低剂量组给予中药25 g·kg-1·d-1灌胃，假手术组、模型组给予生理盐水3.5 ml/d灌胃，早晚各一次，连续给药15 d。

1.4ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的表达 大鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血，严格按照ELISA 试剂盒的操作步骤，在LIR系统和酶标仪中将相应的参数设置好，对标准品倍比稀释，选择相应的板条，空白对照孔不加样，标准品孔加标准品50 μl、链霉辣根过氧化物酶标记的链霉素和素(SA-HRP)50 μl，待测样品孔加入标本40 μl、相应抗体10 μl、SA-HRP 50 μl，盖封版膜、轻轻震荡均匀，37℃温育60 min，将30倍浓缩液用蒸馏水30倍稀释备用，揭掉封版膜，弃去液体、甩干，加洗涤液，静置30 s弃去，重复5次，每孔加显色剂A、B各50 μl，混匀，37℃避光显色15 min，每孔加终止液50 μl，在加入终止液10 min内，以空白孔调零，450 nm波长测量各孔吸光度值，根据标准品浓度及各孔OD值计算标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值分别计算血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的相应浓度。

1.5大鼠脑组织含水量测定 采用干湿重法测定脑组织含水量〔6〕，每组随机选取8只大鼠断头处死，取右侧脑组织，于电子天平(精确度0.1 mg)测得湿重，然后置于100℃的烤箱内烘干24 h，恢复室温后，测得干重。脑组织水含量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6脑组织苏木素-伊红(HE)染色 每组剩余8只大鼠断头处死，分离脑组织，以注血处为中心切取右侧脑组织，10%甲醛固定48 h，石蜡包埋，5 μm厚冠状切片，进行HE染色，于400倍镜下观察神经元形态。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1各组一般情况 实验选用造模成功的大鼠64只，分成4组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。实验过程中大鼠一般状态及精神良好，无脱毛、虚弱、体重减轻等情况，假手术组大鼠活动最为旺盛，低、高剂量组大鼠活动力稍强于模型组。整体而言，低、高剂量组大鼠的粪便量是模型组的2倍，大便较模型组颜色稍浅且柔软，高剂量组大便稍多于低剂量组。

2.2神经功能评分 造模后6 h神经功能评分模型组与低剂量组、高剂量组比较差异无统计学意义(t=0.27，P=0.79；t=0.11，P=0.91)，假手术组与模型组差异有统计学意义(t=18.46，P=0.00)；给药15 d后，与模型组相比，低、高剂量组大鼠神经功能评分明显降低(t=10.80，P=0.02；t=12.48，P=0.00)。见表1。

2.3各炎症因子指标比较 与假手术组相比，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α的含量显著升高(t=-20.31、-41.30、-4.61、-14.00，均，P=0.00)；与模型组相比，低剂量组大鼠血清IL-6、IL-17A含量明显降低(t=8.50，P=0.02；t=2.22，P=0.03)，IL-1β、TNF-α的含量显著降低(t=5.62，P=0.00；t=3.06，P=0.01)，高剂量组大鼠血清IL-17A含量明显降低(t=2.37，P=0.02)，IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著降低(t=8.56、10.85、3.90，均P=0.00)。见表2。

表1 四组神经功能评分比较分)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2 炎症因子指标比较

2.4脑组织含水量 与假手术组〔(61.62±2.56)%〕相比，模型组大鼠脑组织含水量显著升高〔(77.62±1.77)%,t=-12.50,P=0.00〕；与模型组相比，低剂量组大鼠脑组织含水量明显降低〔(75.75±1.67)%,t=5.84,P=0.04〕，高剂量组大鼠脑组织含水量显著降低〔(69.43±1.27)%,t=9.89,P=0.00〕。

2.5各组大鼠脑组织神经元形态及密度的变化 假手术组神经元数量较多为(39.25±2.31)个，形态完整，呈椭圆形，有较长的凸起，胞质呈红色，细胞核大而圆，呈蓝色，于神经元中央；与假手术组比较，模型组部分神经元脱失，呈空泡状，胶质细胞显著增生，可见大量噬神经现象，正常神经元数量显著减少〔(10.00±1.31)个，t=20.78，P=0.00〕；与模型组相比较，低、高剂量组正常神经元显著增加〔(24.62±3.20)个，t=-13.46，P=0.00；(32.62±2.39)个，t=-17.83，P=0.00〕，噬神经现象明显减少。 见图1。

图1 各组大鼠脑组织神经元形态(HE，×400)

3 讨 论

脑出血发生后，以脑水肿为代表的继发性脑损害是影响脑出血患者康复的重要因素，但目前并没有特效的治疗方案〔7〕。在脑出血的急性期，多以痰热互结为主要病机，运用化痰通腑的中药，取其“急则治其标，损其偏盛”的原理，具有恢复气机、通痹达络、引火下行、急下存阴、以防发生劫阴内陷等变证的作用。同时传统的中医理论认为“离经之血便是瘀血”，清代医家唐容川在《血证论》中也说“既是离经之血，虽清血鲜血，亦是瘀血”，在治疗上提出“瘀血不去，则出血不止，新血不生……故凡血证总以去瘀为要”，是以活血化瘀亦是脑出血的治疗大法之一，而脑水肿的病机为“瘀”和“水”，故治疗上应配伍活血化瘀，行气利水之中药。此次研究中用到的星蒌承气汤加味由胆南星、瓜蒌、大黄、芒硝、水蛭、花蕊石、三七粉、郁金、桃仁、川牛膝、泽泻、生白术、车前子、茯苓、益母草、甘草组成，方中大黄配伍芒硝为君药，具有泻下攻积、清热消肿的功效，使“水”由大便而出；胆南星、全瓜蒌可化痰开窍、清火醒神，花蕊石、三七、郁金、桃仁、川牛膝、益母草活血化瘀，共为臣药；同时佐以生白术、车前子、茯苓行气利水，甘草调和药性为使药，诸药合用共奏开窍醒神，活血化瘀通腑，行气利水之功效。现代药理研究亦为中药治疗脑出血后脑水肿提供了理论依据：星蒌承气汤(胆南星、瓜蒌、大黄、芒硝)可以降低颅内压，增加有效的循环灌注，改善脑缺血区的微循环〔8〕。姜黄素(中药郁金提取物)可通过抑制脑出血后的核因子(NF)-κB 通路，减少部分炎症因子的表达和T 淋巴细胞渗入大脑，从而有效减轻脑出血后脑水肿的发生〔9，10〕。水蛭素(中药水蛭提取物)具有抗凝血酶活性、改善血脑屏障(BBB)通透性 、减轻脑水肿 、促进神经元功能恢复等作用〔11〕。三七总皂苷可促进脑出血后血肿吸收、减轻炎症反应、改善微循环、减轻脑水肿，促进脑出血后神经元的损伤修复〔12〕。

脑出血后的炎症反应是导致脑水肿发生的主要机制之一，脑出血发生后，局部及全身的炎症反应被激活，由以小胶质细胞最先被激活，释放包括IL-1β、IL-6、TNF-α在内的一系列炎症因子〔13〕。实验表明，在脑出血急性期，血液中IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α等与脑内炎症反应最相关的炎症因子水平显著增加〔13，14〕。其中，IL-1β主要来源于M1型小胶质细胞〔13〕，IL-6 来源于M1型小胶质细胞和其他免疫细胞(如中性粒细胞)〔14〕，IL-17A主要来源于γ δ T 细胞，IL-1β、IL-6、IL-17A均可通过多种机制促进炎症的发展(如促进其他炎症因子的表达和直接参与炎症反应过程)，加重神经炎症和脑出血后继发性损伤〔12～15〕，抑制IL-17A的分泌，可显著降低脑组织水含量和改善脑出血小鼠的神经功能〔16〕。TNF-α可刺激TNF受体，诱导其下游蛋白质的生物学活性，导致炎症的发生及细胞的凋亡〔3〕。脑出血后血液中的巨噬细胞和中性粒细胞在血肿周围地区高度激活，对IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、凝血酶、血红素等炎症因子做出反应，这些炎症信号与细胞表面的Toll样受体(TLR)4结合，导致NF-κB信号通路的激活和其他炎性细胞因子、活性氧和活性氮的产生，从而加重脑组织损伤，TLR4缺陷的小鼠，体内TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显降低，其脑出血后行为能力可得到明显的改善〔16〕，表明抑制脑出血后炎症因子的表达可有效预防及减轻脑出血后脑水肿的发生及神经功能的损伤。

在西医治疗的基础上，加用活血化瘀，化痰通腑等中药对于脑出血患者的治疗效果更加显著。本研究提示星蒌承气汤加味可有效起到通腑之效，以实现“水”由大便而出的目的；星蒌承气汤加味可改善脑出血大鼠的神经功能；星蒌承气汤加味可降低IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α等炎症因子的表达，抑制脑出血诱发的炎症反应；星蒌承气汤加味可有效降低脑出血大鼠脑组织的含水量，减轻脑出血后脑组织水肿；星蒌承气汤加味可有效减轻脑出血灶周围脑组织的损害，保护脑的神经功能，提高脑出血患者日常生活能力。