棘头梅童鱼胚胎发育和仔鱼形态观察

刘俊果,宋炜,蒋科技,梁述章,张凤英,谌 微,马凌波

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090； 2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

棘头梅童鱼(Collichthyslucidus)俗称梅子鱼、小金鳞、大头宝等，属鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，梅童鱼属，为近海中下层小型鱼类，广泛分布于我国沿海及河口，是近海尤其是河口区重要的小型经济鱼类[1-3]。棘头梅童鱼肉质细嫩，味道鲜美，且终年可以捕获，深受沿海居民的喜爱[4-5]。然而，棘头梅童鱼有限的种群规模和繁衍速率难以满足市场需求，现已出现过度捕捞和种群衰退的危险[6]。

鱼类早期生活史的研究，是鱼类自然资源繁殖保护和养殖业苗种培育的基础[7]。鱼类胚胎发育和胚后发育的形态观察和描述，对其发育生物学、繁殖生物学、人工繁育及之后的育种研究都具有重要的指导作用[8-11]。国内外有关棘头梅童鱼的研究报道主要集中在资源调查[12-15]、形态鉴定[16]、遗传结构分析[17-18]和功能基因克隆[19]等方面，而其早期发育研究尚未见报道。本文在项目组对棘头梅童鱼人工繁育技术攻关与研究基础上，对棘头梅童鱼胚胎及仔鱼形态特征进行观察和描述，旨在填补该方面资料的空白，探明棘头梅童鱼早期生活史阶段的发育规律，为规模化人工繁殖和苗种培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 受精卵来源

2016年5～6月，在福建省宁德市富发水产有限公司试验场开展了棘头梅童鱼人工繁育试验。选择形体完整、体质健壮、鳞片完整、无外伤无畸形的亲鱼。并且雄性亲鱼轻压腹部有乳白色浓稠的精液流出，在水中呈线状，并能很快散开；雌性亲鱼上下腹部均较膨大，卵巢轮廓明显，轻压鱼腹，则有游离的成熟卵从生殖孔中溢出。试验用成熟亲鱼65尾，平均体长14 cm，平均体质量45 g。采用干法人工授精所获的受精卵，放入5.0 m×2.0 m×1.6 m的水泥池中充气培养。

1.2 方法

1.2.1 胚胎发育观察

从人工授精时开始取样，在显微镜下作连续观察和拍照，每次观察取样30粒以上，胚胎发育时间以50%以上个体到各期的时间为准。

1.2.2 仔鱼形态特征观察

从初孵仔鱼开始定期取样，在解剖镜下对仔鱼形态发育情况进行观察和拍摄，并测量相关形态学数据，用5%福尔马林溶液固定标本备查。

1.2.3 数据和图像处理

使用Excel 2013对实验数据进行统计分析，照片用photoshop CS2进行编排。胚胎发育各时期的积温为胚胎某发育阶段的时间与水温的乘积。

2 结果与分析

2.1 胚胎发育

在水温25.0～26.0 ℃、盐度27～28、pH 8.0、溶解氧6.5 mg·L-1的条件下培育，棘头梅童鱼胚胎从受精卵到孵化出膜历时20 h 20 min，积温518.5 h ℃。根据棘头梅童鱼胚胎发育特点，整个发育过程可分为合子、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成及出膜7个阶段共24个时期，各时期发育主要特征和所需时间见表1。

表1 棘头梅童鱼胚胎发育特征Tab.1 Features of embryonic development of Collichthys lucidus

2.1.1 合子阶段

棘头梅童鱼受精卵为圆球形，无色透明，中央有1个油球，卵径(1.182±0.041) mm，油球径(0.458±0.015) mm。受精卵遇水膨胀，并可见卵周隙，随后原生质逐渐向动物极集中，隆起形成扁平状的胚盘。在静水状态下，原生质集中的动物极朝下，植物极朝上。

2.1.2 卵裂阶段

棘头梅童鱼受精卵胚盘不断隆起，面积逐渐扩大，受精后42 min开始第1次卵裂，属经裂，在胚盘中部形成一条分裂沟，将胚盘分裂成两个大小基本相同的分裂球，此时胚胎进入2细胞期(图版Ⅰ-1)。受精后46 min开始第2次分裂，在两个细胞中部出现分裂沟并不断加深，与第1次分裂沟垂直相交将2细胞经裂成大小均等的4个细胞(图版Ⅰ-2)。受精后1 h 4 min开始第3次分裂，同样为经裂，在4个细胞的中央出现纵裂沟并不断加深，相交成直角，将4细胞分裂成8个形态、大小略有差异的细胞(图版Ⅰ-3)。受精后1 h 12 min开始第4次分裂，将胚胎经裂为16个形态不规则的细胞(图版Ⅰ-4)。受精后1 h 32 min开始第5次分裂，动物极分裂形成32个排列不规则的细胞，且细胞大小、形态明显呈不规则状态(图版Ⅰ-5)。受精后1 h 47 min开始第6次分裂，分裂成64个排列不规则的细胞，细胞体积变小(图版Ⅰ-6)。64细胞期以后，细胞依次分裂下去，细胞数量不断增加，体积不断减小，在受精后2 h 29 min细胞排列紧密，界限尚清，形似桑椹，已进入多细胞期(图版Ⅰ-7)。

2.1.3 囊胚阶段

卵裂继续进行，且细胞分裂的更加细密，界限变得模糊不清，至4 h 19 min，在动物极胚盘隆起，色泽加深，形似一高帽状结构凸起于卵黄上，进入高囊胚期(图版Ⅰ-8)。此后胚盘四周细胞分裂明显加快，边缘细胞团向周围扩展，并逐渐向植物极下包，胚盘隆起逐渐降低，至5 h 11 min，呈扁平状，进入低囊胚期(图版Ⅰ-9)。

2.1.4 原肠胚阶段

受精后5 h 49 min，囊胚层边缘细胞团继续向植物极扩展，并通过下包、内卷的方式使边缘细胞层不断增厚，胚盘四周光线透过减弱，在显微镜下可见较暗的环状的胚环结构，进入原肠初期(图版Ⅰ-10)。受精后6 h 44 min，胚层细胞继续下包、内卷，胚环扩大下包卵黄1/3，形成胚盾雏形，胚胎发育至原肠中期(图版Ⅰ-11)。受精后7 h 34 min，胚盘下包卵黄达1/2，胚盘背侧正中位置隆起形成神经板，胚盾不断延伸，胚体雏形初现，此时进入原肠后期(图版Ⅰ-12)。

2.1.5 神经胚阶段

受精后7 h 55 min，胚盘下包卵黄囊1/2以上，卵黄囊大部分被胚层包裹，神经板两侧向背部隆起，在胚盾中央出现神经索，胚体形成(图版Ⅰ-13)。受精后8 h 19 min，胚盘下包2/3，胚体包卵黄1/3，并出现肌节3～4对，植物极大部分卵黄被胚层包裹，在胚孔末端仍有少量卵黄裸露形成卵黄栓(图版Ⅰ-14)。

2.1.6 器官形成阶段

受精后9 h 3 min，胚体包卵黄1/2，脑部开始分化，胚孔尚未关闭，肌节5～6对，在前脑两侧出现1对眼泡，眼囊形成(图版Ⅰ-15)。受精后10 h 16 min，胚体中胚层不断分化，与眼囊相对应的另一端胚体收缩，胚孔完全封闭，此时胚体有头尾之分，柯氏泡出现，肌节9～10对(图版Ⅰ-16)。受精后11 h 24 min，眼囊中晶体出现，柯氏泡尚未消失，肌节13～15对(图版Ⅰ-17)。受精后14 h 34 min，胚体包裹卵黄2/3，柯氏泡消失，肌节16～17对，原胚孔闭合端分化加快，胚体后端不断伸长，形成椎状尾芽(图版Ⅰ-18)。受精后15 h 52 min，圆椎状尾芽不断延长，可见尾鳍褶形成并包裹尾芽，肌节27对，油球部分出现放射状色素，胚体后部出现点状红色色素，进入尾鳍褶形成期，而此时胚体头部的结构进一步复杂化，脑室隆起，耳囊形成(图版Ⅰ-19)。受精后16 h 25 min，心脏开始搏动，心率在90次·min-1左右，心脏位于胚体头部后方，贴卵黄囊侧，心脏已有心室、心房之分，跳动相对微弱(图版Ⅰ-20)。受精后17 h 14 min，尾部从卵黄囊上分离出来，并延伸占胚体的1/3，肌节30对(图版Ⅰ-21)。受精后18 h 52 min，心脏有节律的持续跳动，尾鳍分化明显，伸长可接近头部，尾部随胚体作间断性颤动，进入肌肉效应期(图版Ⅰ-22)。

2.1.7 出膜阶段

受精后20 h 20 min，卵膜变得松弛并出现褶皱，胚体头部在膜内摆动使卵膜不断隆起，致使靠近头部的卵膜最先破裂，此时心率110次·min-1左右，膜内胚体的颤动不断加强，尾部摆动更加剧烈，最后仔鱼破膜而出，完成整个胚胎发育过程(图版Ⅰ-23)。

2.2 仔鱼发育阶段

2.2.1 早期仔鱼(0～8日龄)

风险是不确定性对目标的影响，也可理解为损失的不确定性。只要某件事是否发生、是否致损以及致损程度存在多种可能性，这件事就存在风险。从概率学的角度来解释，某件事损失必然发生的概率为1，必然不发生的概率0，如果损失发生的概率区间为(0,1)，则认定该事件存在风险。

从初孵仔鱼至卵黄囊和油球完全吸收，转为外源性营养阶段。

0日龄(图版Ⅱ-1)，即初孵仔鱼，全长(2.536±0.059) mm，卵黄囊长径(1.253±0.064) mm，油球径(0.412±0.072) mm。此时仔鱼头部弯曲紧贴卵黄囊，身体纤细呈透明状态，沿脊椎有几处放射状黑色素分布；油球位于卵黄囊后侧靠近消化道；眼球较突出，后脑发达；肠道直细无弯曲，口与肛门皆呈封闭状；尾部细直为主要运动器官，此时仔鱼运动能力差，靠卵黄悬浮于水体中部，偶尔尾部摆动加剧，在水体中做间歇性窜动。

1日龄(图版Ⅱ-2)，全长(3.453±0.056) mm，卵黄囊长径(1.191±0.040) mm，油球径(0.489±0.136) mm。相比初孵仔鱼卵黄略微缩小，油球仍位于卵黄囊后部；耳石明显，眼囊突出(图版Ⅱ-a)，无色素沉着，后缘有块状红色色素；第16肌节处也有红色色素；鳍褶膜略微增宽，有颗粒状斑点；肠道开始增粗，无弯曲(图版Ⅱ-A)。

2日龄(图版Ⅱ-3)，全长(4.020±0.141) mm，卵黄囊长径(1.170±0.116) mm，油球径(0.483±0.037) mm，相比于1日龄仔鱼卵黄囊明显缩小，眼球变大，眼缘及肌节处色素扩散；听囊及耳石更加明显(图版Ⅱ-B)；鳔原基出现，不明显，未充气；胸鳍出现，呈透明扇状；肠道褶皱出现；血液循环明显，在显微镜下可见红细胞穿梭于血管；泄殖腔明显。

3日龄(图版Ⅱ-4)，全长(4.031±0.078) mm，卵黄囊长径(0.756±0.031) mm，油球径(0.445±0.057) mm，卵黄囊消耗所剩无几，油球凸显；眼囊出现色素沉着(图版Ⅱ-b)，颜色加深；脑部较发达；口膜开裂，但无张合现象；鳍褶逐渐向后退缩，肠道褶皱增多。

4日龄(图版Ⅱ-5)，全长(4.087±0.166) mm，卵黄囊长径(0.744±0.099) mm，油球径(0.440±0.025) mm，卵黄囊与油球紧贴；口裂加深、扩大，出现张合现象，牙齿已见雏形，包裹于膜内；整个眼球呈黑色，晶状体并不清晰(图版Ⅱ-c)；仔鱼已能正常平游，作间歇性窜动；头部与尾部红色素明显；鳔已充气；脊椎骨弯曲；肠道出现弯曲，末端膨大。

5日龄(图版Ⅱ-6)，全长(4.121±0.157) mm，油球径(0.429±0.069) mm，卵黄囊吸收接近完全(图版Ⅱ-C)；眼球和晶体呈黑色(图版Ⅱ-d)；胸鳍发达；肠道形成一个“S”型弯曲(图版Ⅱ-D)，肠道蠕动明显；肛门与外界相通；此时仔鱼开始主动摄食轮虫，进入混合型营养阶段。

6日龄：全长(4.267±0.069) mm，腹部及油球位置出现放射状黑色素；头部出现隆起；牙齿基本发育完全(图版Ⅱ-E)，摄食行为明显加强；鳃盖形成并可见清晰鳃耙。

8日龄：全长(4.298±0.218) mm，眼球径(0.267±0.029) mm，油球耗尽；消化道可见褐色粪便(图版Ⅱ-F)；尾部点状色素增多。

2.2.2 晚期仔鱼(9～25日龄)

从完全依赖外源性营养至各鳍鳍条已成定数、鳞片开始出现为止。

9日龄：全长(4.312±0.524) mm，眼球(图版Ⅱ-e)长径约0.333 mm，短经约0.258 mm，此时油球消失(图版Ⅱ-G)，混合型营养结束，；仔鱼进入完全依赖外源性营养阶段，可见泄殖口排出褐色粪便；头部硬棘明显；鳃盖上有硬棘，每个鳃盖2个；腹部有放射状色素向上延伸；尾部出现斜状鳍条分化。

10日龄：全长(4.348±0.334) mm，仔鱼头部进一步复杂化；上下颌分化继续加强，出现绒毛状细齿；此时仔鱼可摄食丰年虫，肠胃可见饵料食物。

12日龄(图版Ⅱ-7)：全长约(4.510±0.314) mm，体高增高明显；可见细长的鳔管，与食道相通；此时肠仍为一道弯曲；背鳍原基出现；尾鳍出现轻微上翘。

16日龄：眼球(图版Ⅱ-f)长径约0.538 mm，短经约0.521 mm；摄食能力明显加强，胃内发现桡足类饵料，肠蠕动增强；胸鳍鳍条5～6条；背鳍发育尚不完善，鳍条约23条；臀鳍棘条2根，鳍条约11条；尾鳍发育完善，鳍条19～20条；仔鱼游动能力加强，控制运动方向更加灵活。

18日龄：口吻咬合能力突出，摄食桡足类为主；背鳍发育较完善，鳍棘8～9根，鳍条约25条；胸鳍已相当发达，仔鱼在水体中平衡能力增强；腹鳍已出现，发育尚不完善，鳍条2～3条。

20日龄：此时仍能清晰看到心脏搏动，仔鱼多集群分布于水体中上层；腹鳍发育较完善；鳃盖色彩绚丽；肛门后至尾鳍基部有点状黑色素分布；鳃盖后侧及背部也出现点状黑色素。

25日龄(图版Ⅱ-8)：此时仔鱼头大而钝短，额部隆起，已具枕骨棘；尾柄细且长，已具棘头梅童鱼典型特征，可明显区分于同时期大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)。眼球与成鱼无异，无眼睑(图版Ⅱ-g)；此时仔鱼多分布于水层中下部，鱼鳔作用明显；且多集群于池角，善绕池壁游动，对光线敏感，趋光性强；可见脊椎下侧动脉血液的流动，眼部上缘硬棘4根，沿上颌分布有大片色素区；下缘有不明显硬棘8根；鳃盖呈蓝色，鳃盖膜不与峡部相连；头骨较松软，黏液腔发达；胸腹部呈蓝色不透明，背部点状黑色素增多，腹部出现放射状色素；背鳍、胸鳍、腹鳍、尾鳍、臀鳍都已出现骨质鳍条，且发育完善；腹部可见鳞片出现。至此，标志着棘头梅童鱼仔鱼发育阶段的结束，稚鱼发育阶段的开始。

3 讨论

3.1 几种石首鱼类胚胎发育特征比较

同其它几种常见的石首鱼科鱼类一样，棘头梅童鱼的鱼卵为圆球形的浮性卵，无色透明状，中间有油球一个。由表2可知，几种石首鱼科鱼类的鱼卵在卵径、油球径和初孵仔鱼全长存在种间差异。这种石首鱼鱼科类中卵径和油球径的种间特异性，被认为可以作为区分黄鱼属和其它石首鱼科鱼类的判断依据[20]。鱼卵的大小对于鱼类早期发育和存活具有重要的意义，对不同的鱼类来说，卵径较大的鱼卵一方面发育速率可能越慢[21]，另一方面大的卵黄和油球会延长仔鱼阶段内源性营养向外源性营养转变的时间，这对仔鱼建立初次摄食、提高存活率具有重要意义[8, 22]。卵的大小和仔鱼的大小呈正相关，个体较大的仔鱼生长快，摄食和避敌能力强，存活率相对较高[8]。从表2中可以看出，黄鱼属鱼类的卵径、油球径和初孵仔鱼要大于其它几种石首鱼科鱼类。有学者认为，初孵仔鱼愈大，其口裂也相对较大，优势就是开口饵料相对容易获取，这也是大黄鱼的人工育苗比其它石首鱼科几种经济鱼类更易成功的因素之一[20]。

适温范围内，棘头梅童鱼的孵化时间与水温之间呈负相关，即水温愈高，孵化时间愈短。本研究中，当孵化水温在22.8 ～ 23.8℃时，孵化时间是22 h 30 min；水温在24.5 ～ 25.0℃时，时间是21 h 58 min；水温在25.4 ～ 25.5℃时，时间是20 h 20 min；水温在25.8 ～ 26.5℃时，时间是17 h 39 min。但是高于或低于适当水温时，出现死卵数或孵出仔鱼畸形率均有所升高。通过对石首鱼科几种鱼类孵化温度和孵化时间的比较(表3)发现，随着孵化温度的升高，胚胎发育的速率加快，发育时间相应缩短，然而盐度的作用并不明显[20]。

3.2 几种石首鱼科鱼类仔鱼发育特征比较

鱼类早期发育可分为胚胎期、仔鱼期(早期仔鱼或卵黄囊仔鱼和晚期仔鱼)、稚鱼期和幼鱼期；其主要依据是器官结构的发育程度、营养和摄食特征的变化[7]。在早期仔鱼时期，营养供应方式分为内源性和混合性，在晚期仔鱼时期营养方式则为外源性的。当仔鱼尚未开口摄食，尚无摄食能力，营养依赖卵黄囊和油球的供应，仔鱼绝大部分体积被卵黄囊占据，移动避敌能力弱。当仔鱼建立初次摄食以后，一方面仔鱼开始主动摄食，另一方面内源性的营养尚未耗尽，依然承担一部分营养的消耗。这一时期为混合性的营养方式，也说明与仔鱼摄食、消化等相关的器官进一步发育完善。当内源性的营养全部耗尽，则营养方式完全转变为外源性营养供给，外源性营养方式的建立标志着这一阶段仔鱼的饵料搜寻、捕获及消化吸收等器官功能的发育完善，同时也表明与运动相关的器官进一步完善[28]。

表4为几种石首鱼科鱼类仔鱼发育特征的比较，初次摄食的建立、卵黄囊的耗尽、油球的耗尽以及鳍条的完善，是石首鱼类早期发育中比较关键的特征变化。如上所述，这些特征的改变不仅是划分各时期的重要依据，同时也意味着与之对应的视觉、摄食、消化和运动等器官的形成。

表2 7种石首鱼科鱼类的受精卵和初孵仔鱼全长比较Tab.2 Comparison of the zygote and whole length of newly hatched larvae of seven Sciaenidae fishes

表3 7种石首鱼科鱼类孵化水温、盐度与时间的关系Tab.3 Relationship between incubation temperature, salinity and time of seven Sciaenidae fishes

表4 6种石首鱼科鱼类仔鱼阶段主要特征的比较Tab.4 Comparison of main characteristics of six Sciaenidae fishes at larvae stage

3.3 仔稚鱼发育时期的划分依据

有关海水鱼类仔稚鱼发育时期划分的问题，学者们的观点不尽相同。目前对仔稚鱼划分方法使用较为广泛的主要有3种[29]，第一种是根据卵黄囊、油球变化、体表形态和营养方式的改变，将棘头梅童鱼胚后发育划分为早期仔鱼、晚期仔鱼和稚鱼期。第二种是以主动开口摄食为依据来界定早期仔鱼与晚期仔鱼，早期仔鱼即卵黄囊仔鱼(yolk-sac larvae)是指从出膜至开口摄食前，晚期仔鱼指从初次开口摄食到器官发育基本完全，包括混合营养期和外源营养期；支持该观点的学者认为主动开口摄食是仔鱼发育阶段一个重要的标志，揭示仔鱼消化器官发育基本完全、主动避险能力加强等，是影响仔鱼存活的关键因素之一[29]。第三种是根据尾椎的弯曲情况，将胚后发育划分为前弯曲期、弯曲期、后弯曲期、稚鱼等不同阶段[21]，支持该观点的学者认为在仔鱼的发育过程中，诸如鳍条形成、外部形态的塑造以及摄食和避险能力的加强等特征均与脊索弯曲相关[30]。此外，通过鉴定石首鱼科鱼类头部枕骨棘也是划分仔稚鱼的重要方法之一[9, 31]。棘头梅童鱼的枕骨棘从稚鱼阶段保留到幼鱼时期；大黄鱼和小黄鱼(Pseudosciaenapolyactis)则在成鱼时期消失；鮸鱼(Miichthysmiiuy)在整个早期发育过程中并不出现枕骨棘。在硬骨鱼类胚后发育研究中第一种方法使用较为广泛，本研究也采用了第一种划分依据，同时结合鳍条形成和鳞片发育等形态学特征，将棘头梅童鱼胚后发育过程划分为早期仔鱼、晚期仔鱼以及稚鱼期。

本研究中划分早期仔鱼和晚期仔鱼的依据为内源性营养是否耗尽，在已报道的一些文献中对内源性营养器官的界定仅仅局限在卵黄囊。但在生产实践中发现，当棘头梅童鱼至孵化后4 d时，卵黄囊已消耗殆尽；然而，油球仍然为正常的生长发育供给所需营养，直至8 d时才消耗完全。所以，内源性营养器官应包括卵黄囊和油球，两者共同提供早期仔鱼生命活动所需的能量。虽然8日龄时内源性营养才消耗完全，但在5日龄时已主动摄食轮虫，此时仔鱼处在一个过渡型的营养阶段，即混合型营养期。混合型营养阶段在早期仔鱼向晚期仔鱼的转变过程中有特殊的意义，它能够降低仔鱼因生理机能或器官发育不协调所造成的较高死亡率。对棘头梅童鱼晚期仔鱼与稚鱼的划分，采取了与大多数学者基本一致的观点，即各鳍条形成和运动器官发育完备，但稍有不同的是此时棘头梅童鱼稚鱼腹部已出现鳞片。棘头梅童鱼仔鱼初次摄食现象出现在5日龄，仔鱼初次摄食所要求的饵料密度、大小和质量等条件亦是影响仔鱼存活的关键之一，所以仔鱼饵料的科学配合以及微囊饲料研究得到极大关注。随着日龄的不断增加，尤其是消化器官的发育完善，对营养的需求不断增大，在早期培育过程中适当增加饵料的投喂量、投喂次数以及适时分池处理对提高成活率尤为重要。