餐厨垃圾发酵液淋洗前后土壤肥力及微生物多样性变化

戴世金，周紫薇，张子莎，雷茗淇，赵由才

(同济大学 环境科学与工程学院污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海 200092)

1 引 言

餐厨垃圾是城市固体废弃物中的重要组成部分，其含水率、有机物含量均较高，富含脂肪、蛋白质、碳水化合物等可生物降解的有机物质及大量的盐分，已被认为是发达国家与发展中国家经济、社会、环境领域的共同问题[1]。据统计，我国有660个城市，各类餐馆有350多万家，餐厨废弃物日均产量超过50吨的城市有512个，餐饮企业每年产生的餐厨废弃物约4 000万吨，可利用餐厨废弃物总量每年有3 000万吨[2]。

目前来看，厌氧发酵不仅可以通过微生物的作用将餐厨垃圾降解，还可以实现部分资源 化与能源化，已经成为我国规模化处理的主流技术[3]。然而，在发酵过程中，大量剩余的厌氧发酵液(沼液)如何处理就成为建设单位迫切需要解决的问题。发酵液产生量大，若全部就地消纳利用存在难度；若采用远距离输送，则建设单位难以承受它的高能耗和高成本；若任意排放，不进行即时处理，则又可能给环境带来二次污染的风险[4]。

餐厨垃圾厌氧发酵液是一种难处理的高浓度有机废水，化学组成以溶解性蛋白质、糖类、动物脂肪、有机酸和无机盐为主[2, 5]。餐厨垃圾发酵液中有机质、氮、磷含量高，重金属含量低，有毒有害成分少，是植物生长的良好肥料和土壤的理想改良剂。施用发酵液可改善土壤环境，有利于调节土壤pH值，增加土壤中氮、磷、钾和有机质含量[6]。同时，发酵液中含有的氨、腐殖酸、维生素和植物激素类对土壤中的病原菌有明显的生长抑制作用[7]。根据我们之前的研究发现，发酵液中的大量有机酸不仅可作为微生物碳源[8]，也可以用于重金属土壤修复中的淋洗剂[9]。然而，由于餐厨垃圾成分复杂，在淋洗过程中，土壤中的多种有机组分和微生物与土壤相互作用，对土壤产生一定的影响。本文针对餐厨垃圾发酵液淋洗土壤前后，研究土壤的理化性质变化和微生物群落变化。

2 材料与方法

2.1 发酵液淋洗的土壤制备

餐厨垃圾发酵液来自于餐厨垃圾发酵9 d后的稳定发酵液，淋洗采用质量比为10∶1的淋洗液和土壤比[9]，采用翻转振荡的方法持续淋洗一定时间，设立空白组和对照组。淋洗土壤样品分为六组实验：0(原始土壤)、L-1(发酵液淋洗12 h)、L-2(发酵液淋洗24 h)、W-1(水淋洗12 h)、W-2(水淋洗24 h)、UV(发酵液淋洗12 h同时紫外光灭菌照射)。每种土样取部分于50 mL的离心管中，置于-20℃冰箱中以备DNA提取和土壤理化性质检测。

2.2 土壤性质和肥力的测定

测定土壤淋洗前后的pH、有机质、阳离子交换量(CEC)、有效氮、总氮、总磷、有效磷、可交换钾/钙/钠/镁等性质。土壤pH的测定参考ISO10390∶2005标准方法，干燥后以1∶5的比例溶于水后，采用pH计(PHSJ-4F，上海仪电科学仪器股份有限公司)测定上清液的pH值。土壤有机质、CEC和可交换离子含量参照标准土壤分析方法。

2.3 微生物群落测试方法

土壤微生物群落的测试由美吉生物完成(上海，中国)，其主要的工作流程如下。

2.3.1 基因组DNA抽提

用Mobio PowerSoilRRDNA Isolation Kit提取土壤样品中微生物总基因组DNA，并利用Mobio PowerCleanRRDNA Clean—Up Kit完成对DNA的纯化，纯化后的DNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.3.2 PCR扩增

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件：尽可能使用低循环数扩增；保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型；

全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。

2.3.3 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.3.4 Illumina平台文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.3.5 Illumina平台测序

DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”，PCR扩增，产生DNA簇，DNA扩增子线性化成为单链。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种，将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸，统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

2.3.6 生物信息化流程

使用的Usearch软件(version 7.1) ，根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。然后在去除嵌合体序列后进行OTU聚类分析，对OTU的代表序列作分类学分析[10]。基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；基于系统发育可以进行unifrac等分析。在上述分析的基础上，可以进行一系列群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析[11-12]。

3 结果与讨论

3.1 土壤的理化性质

分析发酵液淋洗后对土壤理化性质的影响，如表1。与原始土壤比较，发酵液淋洗后土壤中pH略有下降，酸性略有增强，主要是由于发酵液的酸性较强，使土壤中pH略有降低，土壤的缓冲体系使其变化值不大。另一方面，由于土壤中的离子含量较高，使淋洗后的土壤中阳离子交换量增加，有机质、氮、磷等营养元素明显增加，可一定程度上改善土壤的肥力，这与污泥发酵液施用土壤后的情况类似[13]。而淋洗12 h与淋洗24 h比较发现，土壤的理化性质变化不大，营养成分略有增加。这可能是因为发酵液呈酸性，且其中含有大量的有机物和无机盐，淋洗后土壤肥力增加；淋洗12 h后，土壤中的发酵液已近于饱和，再淋洗至24 h后，土壤理化性质变化不大。

表1 土壤理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of soil

3.2 物种丰度及Alpha多样性分析

6种土样分别进行高通量测序, 6份样品的有效序列数分别为42 255,33 596,38 939,37 953,32 372,31 916条,说明六种土壤中微生物种类丰富，数量较大[14]。为了保证样本测序序列的均一性，按照样本序列最低数量，将所有样本的序列随机抽取至统一数据量，方进行后续分析。计算发现样品覆盖率平均为99.432 2%，基于OTU统计结果绘制稀释曲线如图1所示，随着测序数量的增加，各样品稀释曲线均基本趋于平缓，表明我们的取样基本合理，置信度高，能够比较真实的反映样品的细菌群落。97%的相似度下的物种丰度中，W-2和UV丰度最小，0，L-1，L-2和W-1丰度基本相同，相对较大。说明发酵液淋洗后微生物丰度变化不大，用水淋洗和紫外光照射的情况下，土壤中微生物丰度下降。

图1 稀释曲线Fig.1 The dilution curve

各个样品Alpha多样性指数如表2所示，Shannon指数、chao指数、ace指数越大，simpson指数越小，表明物种越丰富[15]。0，W-1的Shannon指数、chao指数、ace指数均高于W-2，simpson指数均小于W-2，进一步说明用水淋洗后土壤中物种丰度减小。可能是因为水分过量引起土壤中养分流失，有效利用养分的减少使土壤中细菌数量减少，也可能是因为水分过捞致使土壤通气不畅，抑制了部分好气细菌的增长。而0，L-1，L-2的Shannon指数、chao指数、ace指数、simpson指数相近各有大小，进一步说明它们的物种丰度变化不大。可能是因为原始土壤中营养充足，适合微生物生长，虽然土壤理化性质有较大改变，但微生物的多样性变化不大。比较0，L-1与UV的Alpha多样性指数，也可得到结论L-1的物种丰度大于UV，由于紫外光具有杀菌消毒作用，可抑制微生物的增长，因此紫外光照射下微生物丰度下降[16]。

表2 序列统计及Alpha多样性指数Tab.2 The number of OTU and The Alpha diversity indexs of bacteria in each sample

3.3 主成分及热图分析

为分析土壤中微生物差异，进行OTU丰度的PCA分析，如图2所示。分析表明主成分1 (PC1)和主组分2(PC2)在样品差异性贡献率上分别达到84.68%和12.63%,合计达到97%,是差异的主要来源。不同颜色代表不同的样品，样品间距离代表其相似性。L-1与原始土壤距离最近，说明其在主成分上具有相似性。因为L-1淋洗时间较短，微生物变化不大。而L-2和W-2则比较分散，说明在发酵液和水淋洗24 h后，复合菌系中微生物组成存在显著差异。

图3为门水平上的热图，不同颜色表示各门在样品中的丰度，进化树表明样品间的相似程度[17]。从颜色分布可以看出，各个样品在门水平上的差异较小。图3进化树可知0，L-1，L-2发生聚类，W-2相比W-1与这三种样品差别更大，与上述PCA分析结果一致，既原始土壤与发酵液淋洗后的土壤中的微生物群落在门水平上相似，而水淋洗后土壤中的微生物差异较大，淋洗时间较长，差异越大。餐厨垃圾发酵液中含有众多的微生物，并且与土壤中含有的微生物具有差异。当发酵液与土壤进行混合淋洗时，由于酸碱性、有机质等理化性质的差异，导致混合体系中优势菌群发生改变，从而导致土壤中微生物群落的变化[18-19]。土壤淋洗过12 h后，理化性质发生迅速改变，但是微生物的增殖具有一定的适应期，其变化表现出一定的滞后性，因此会带来L-2与L-1，W-2与W-1的差异。可能是因为水淋洗后，改变了土壤环境，部分微生物流失或死亡，微生物群落差异显著；而发酵液淋洗后，土壤中营养物质丰富，微生物群落在门水平变化不大。

图2 PCA分析图Fig.2 The analysis chart of PCA

图3 样品在门水平的热图Fig.3 Heatmap of samples at phylum level

3.4 细菌组成多样性及差异分析

对 OTU 依次进行门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)分类，分析其微生物组成[20]。6个样品中细菌共分布在34个门，其中主要有9个门，所占比例如图4所示。在所考察的原始土样中，Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)均为优势菌门，比例分别为20.6%、44.2%、10.7%。水淋洗的土壤样品W-2中变形菌门的比例大幅度提升为84.1%。发酵液淋洗12h(L-1)土壤中厚壁菌门减少至34.0%，酸杆菌门增至17.8%；但淋洗24h(L-2)后，酸杆菌门却降至8.4%，厚壁菌门增至46.8%。

属分类水平上共检测到370多种微生物，如图5所示，Bacillus(芽孢杆菌属)为原始土样的优势菌，占30.5%，其次为Lactococcus(乳球菌属)占7.9%。L-1与原始土壤中优势菌相同，芽孢杆菌属占26.5%，乳球菌属下降为2.2%。淋洗足够长时间后，L-2中优势菌为Lactobacillus(乳杆菌属)，比例为26.1%，芽孢杆菌属下降至12.4%，而水24h后优势菌种为Novosphingobium(新鞘脂菌属)，比例为66.1%，芽孢杆菌属下降至3.1%，Dechloromonas(氯单胞菌属)上升至12.2%。

图4 样品在门水平上细菌类群比较Fig.4 Comparison of bacteria groups in each sample at phylum level

图5 样品在属水平上细菌类群比较Fig.5 Comparison of bacteria groups in each sample at genus level

4 结 论

4.1 利用高通量测序技术分析样品，平均覆盖率为99.432 2%，测序结果能够全面的反映样品组成及结构。多样性指数可得土壤样品的物种丰富度顺序为：原始土壤、淋洗液淋洗>水淋洗>紫外照射下的淋洗液淋洗。

4.2 根据PCA分析和门水平聚类图，原始土壤与发酵液淋洗土壤微生物群落类似，水淋洗时间越长，与原始土壤的微生物群落差别越大。

4.3 原始土壤中优势菌为Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)，比例分别为20.6%、44.2%、10.7%。发酵液淋洗土壤类似，但比例分别为20.0%～22.0%、34.0%～46.8%、8.4%～17.8%。水淋洗12 h变化不大，淋洗24 h后土壤优势菌门为Proteobacteria(变形菌门)，比例为84.08%。原始土壤的优势菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)，占30.5%，发酵液淋洗24 h后优势菌属为Lactobalius(乳杆菌属) 和Bacillus(芽孢杆菌属)，比例分别为26.1%、12.41%，水淋洗24 h后优势菌属为Novosphingobium(新鞘脂菌属)和Dechloromonas(脱氯单胞菌属)，比例分别为66.1%、12.21%。