葛根素通过Nrf2/ARE通路调控小神经胶质BV-2细胞的氧化应激损伤

李 兵，张 婵，林 芳，李自明，周 剑

（华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030）

帕金森病多常见于老年人，属于一种神经退行性功能障碍病变，临床病症主要为震颤麻痹，病理特征表现在多巴胺能神经元损伤[1]。早期研究表明机体受到氧化应激刺激时，机体氧化/抗氧化系统失衡，抗氧化能力减弱，导致自由基过得堆积，引起机体的严重损伤。其中活性氧（ROS）是氧化应激损伤的主要产物之一，并且在帕金森病发生发展中起着重要的作用[2]。发现核转录因子（Nrf2）可以通过介导抗氧化反应元件（AER）活性来调节氧化应激途径[3]。于是，探讨Nrf2/AER信号通路的调控作用对帕金森病的发病机制的研究具有重大意义。早期也有研究发现葛根素对6-羟多巴胺所致帕金森病大鼠具有保护作用[4]，而且葛根素还可通过Nrf2/ARE信号通路抵抗氧化应激对创伤性脑损伤的神经保护[5]。因此，本文旨在研究葛根素对BV-2细胞氧化应激损伤的保护作用，并对其可能调控Nrf2/ARE信号通路活化这一机制进行探讨。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂 小神经胶质BV-2细胞购买于南京科默生物细胞库；葛根素（武汉远成共创科技有限公司，纯度 98%，批号：23521-698-23）；CCK8试剂盒（上海威奥生物科技有限公司，批号：CJ-150-25）；丙二醛（MDA）试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，批号：SHP-1230-24）；一氧化氮（NO）试剂盒（江苏泽雨生物科技有限公司，批号：HTC-4203-54）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（北京默沙克生物科技有限公司，批号：SJ-1540-93）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：C15740）；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：20170512）；RPMI 1640培养基（Gibco公司，批号：RT-1630-21）；βactin、HO-1、SOD1、Jak2、p-Jak2、State3 及 p-State3一抗均购自美国Sigma公司；对应二抗购自武汉谷歌生物有限公司。

1.2 仪器 酶标仪（南京德铁仪器公司，型号：HBS-1096A）；单人超净台（济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BBS-V800）；细胞培养箱（上海旦鼎国际贸易有限公司，型号：SANYO）；双色红外激光成像系统（美国 BIO-RAD，批号：LI-COR ODYSSEY）。

1.3 BV-2细胞培养 将单人超净工作台及相关实验物品紫外光照消毒30 min，复苏BV-2细胞进行传代培养，1640完全培养基（10%胎牛血清，1%的100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素）于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2 d换液1次，培养3～4 d进行传代培养，并在倒置显微镜下观察细胞形态，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 细胞存活率实验 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞数接种于96孔板中，培养过夜，分为空白对照组、H2O2诱导模型组、H2O2+5μmol/L葛根素组、H2O2+10μmol/L葛根素组、H2O2+20μmol/L葛根素组，培养24 h后吸干旧培养基，每孔加入100μL含10μL CCK8试剂的完全培养基，继续于37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h，然后在波长450 nm处的酶标仪中测定每孔吸光度值。

1.5 细胞匀浆MDA、NO及SOD检测 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞数接种于6孔板中，培养过夜，分为空白对照组、H2O2诱导模型组、H2O2+5μmol/L葛根素组、H2O2+10μmol/L葛根素组、H2O2+20μmol/L葛根素组，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，收集细胞制备成匀浆，按照试剂盒操作说明书进行MDA、NO水平及SOD活性检测。

1.6 免疫印迹检测蛋白水平 取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，取适量细胞数接种于6孔板中，培养过夜，分为空白对照组、H2O2诱导模型组、H2O2+5μmol/L葛根素组、H2O2+10μmol/L葛根素组、H2O2+20μmol/L葛根素组，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，收集细胞、裂解、离心、收集上清、检测蛋白浓度。然后每孔上样量50μg，进行电泳分析、转膜、封闭、孵育一抗过夜、洗膜、孵育二抗、洗膜及蛋白表达分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS20．0软件进行统计分析，实验数据用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较采用LSD法，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对BV-2细胞存活率的影响 采用CCK8试剂盒分析了葛根素对BV-2细胞存活率的影响，结果如表1所示。结果显示：单纯的H2O2刺激可明显降低细胞的存活率，相对于正常对照组差异有统计学意义（P＜0．05）；而经过不同剂量葛根素干预24 h后，可见葛根素可明显提高细胞的存活率，并随着药物剂量升高细胞的相对存活率升高的越明显，表现出浓度依赖性，并且各药物组与H2O2诱导组之间差异均有统计学意义（P＜0．05），药物组两两之间的比较差异也有统计学意义（P＜0．05）。

表1 不同组间BV-2细胞存活率的比较（n=6）Tab.1 Comparison of the survival ratesof BV-2 cellsin different group(n=6)

2.2 葛根素对BV-2细胞氧化应激产物的影响 相关试剂盒分析了葛根素对BV-2细胞氧化应激产物含量的影响，结果见表2。结果显示：单纯的H2O2干预可明显诱导MDA、NO的释放及降低SOD的活性，相对于正常对照组差异有统计学意义（P＜0．05）；经过不同浓度葛根素干预后，匀浆中 MDA、NO的水平显著减少，而SOD酶活性则明显升高，与H2O2诱导组相比差异均有统计学意义（P＜0．05），并且随着葛根素剂量的升高，3种指标与H2O2诱导组之间的差异越显著，表现出浓度依赖性。

表2 不同组别间细胞氧化应激产物的比较（n=6）Tab.2 Comparision of oxidativestressparametersin cells among the groups（n=6）

2.3 葛根素对Nrf2活化与转位的影响 H2O2干预组BV-2细胞中细胞核内Nrf2的表达显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。随着不同剂量的葛根素干预后，胞核内Nrf2的表达显著升高，与 H2O2干预组相比差异均有统计学意义（P＜0．05）。如图1所示。

2.4 葛根素对织Nrf2下游靶基因GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达的影响 H2O2干预组BV-2细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表达显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。随着不同剂量的葛根素干预后，细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表达显著升高，与H2O2干预组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。如图2所示。

图1 葛根素对Nrf2核转位的影响（n=6）Fig.1 Effect of puerarin on Nrf2 translocation in the BV-2 cell(n=6)

图2 葛根素对GCLC、NQO1和HO-1蛋白的影响（n=6）Fig.2 Effect of puerarin on theexpression of GCLC,NQO1 and HO-1 in the BV-2 cell(n=6)

3 讨论

当前有关研究显示，葛根素具有广泛的药理作用，如在治疗高脂血症、糖尿病、老年性痴呆、心脏缺血再灌注损伤等疾病都表现出良好的疗效[6]，并且其针对不同的疾病治疗机制也各不相同。在葛根素改善心脏缺血/再灌注损伤过程中，主要通过诱导PI3K/AKT信号通路活化进一步上调eNOS基因表达来实现。氧化应激属于大量自由基堆积引发的损伤，引起机体氧化/抗氧化系统失衡，而且氧化应激还是导致衰老和病态的一个重要原因[7]。诱导抗氧化因子间协调作用能够帮助恢复抗氧化系统功能，从而有效的对抗氧化应激损伤。H2O2是诱导氧化应激损伤的良好诱导剂，虽然小神经胶质细胞是大脑的神经性免疫细胞，对炎性因子比较敏感，并且还能够进一步诱导氧化应激损伤。然而，文章主要探讨葛根素对BV-2细胞氧化应激损伤的影响，采用H2O2诱导的氧化应激模型比较单一，可以降低其他炎性反应的影响。文章采用H2O2诱导BV-2细胞氧化应激损伤模型，发现H2O2诱导组细胞产生的氧化应激产物MDA及NO显著升高，抗氧化酶SOD活性显著降低，说明氧化应激损伤模型构建成功。经过不同浓度葛根素干预损伤细胞后发现，不同剂量的葛根素可明显增加细胞的存活率、降低氧化应激产物MDA及NO的释放及增强SOD酶活性，提示葛根素对氧化应激损伤的BV-2细胞具有较好的保护作用。

前期研究证实葛根素能够促进脑组织内源性抗氧化剂活性，达到清除脑组织堆积的自由基，缓解氧化应激损伤，改善神经元的损伤[8-9]。但葛根素作用的具体机制尚不是很清楚，已有研究说明人体内多种抗氧化酶均含有一个相同的启动子序列，即抗氧化反应元件（ARE）[10]。其中转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）与ARE结合在抗氧化应激损伤中发挥着关键性作用。Nrf2/ARE信号通路为细胞内作用的抗氧化防御机制，即当机体受到受到外界刺激时发生细胞内氧化还原状态的变化，其中Nrf2能磷酸化进而与Keap1解偶联，进入细胞核，进而与相关基因的ARE序列结合编码靶基因的转录[11]。本文研究发现葛根素可明显增强Nrf2的转位，并诱导其下游靶基因GCLC、NQO1及HO-1蛋白的表达。综上所述，葛根素可明显降低BV-2细胞的氧化应激损伤，其作用机制可能与Nrf2/ARE信号通路的活化有关。