葱白提取物对非酒精性脂肪肝模型大鼠ATPase6、ATPase8表达的影响*

郑 丁 ，时昭红，郭 洁 ，张 书 ，付丽鹤 ，刘 凡 ，涂蓓蕾

（1．湖北中医药大学，武汉 430065；2．武汉市中西医结合医院，武汉 430022）

非酒精性脂肪肝病（NAFL D）是指除酒精和其他明确的肝损害因素外，以肝细胞脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征。西方发达国家发病率为20%～30%，中国成人发病率约15%，且发病呈年轻化的趋势，对人们的生命健康构成了严重的威胁[1-2]。目前临床上没有一种药物被证实治疗NAFLD直接有效，所以寻找新的药物尤为迫切。大量实验研究表明[3-5]，用高脂饮食诱导的NAFLD模型大鼠肝线粒体出现不同程度损伤，肝组织ATP含量显著降低，肝脏出现明显的能量代谢障。ATP合酶是ATP的生成的关键酶，由F0和F1两部分组成，其F0由ATP合酶F0亚基6（ATPase6）、ATP合酶F0亚基8（ATPase8）编码，所以通过提高ATPase6、ATPase8的表达可以增加ATP的合成。本课题组前期研究发现[6-8]，葱白提取物能明显改善NAFLD模型大鼠肝脂肪变性，其中有效成分主要是黄酮类化合物、甾体类化合物、不饱和脂肪酸类化合物、硫化合物等。实验研究发现[9]黄酮类化合物通过抗氧化作用恢复线粒体能量代谢发挥作用。基于上述理论与研究基础，笔者以葱白提取物干预NAFLD模型大鼠，通过苏木精-伊红（HE）染色法观察肝脏组织结构变化，采用 Real time PCR观察肝脏 ATPase6、ATPase8 mRNA的表达，探讨其治疗NAFLD可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠50只，级别SPF级，体质量（180～220）g，由湖北省疾病控制中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2008－0005。

1.2 药物 高脂饲料：72．1%基础饲料+2%胆固醇（国药集团化学试剂有限公司）+10%猪油（市场自购）+5%蔗糖（市场自购）+0．5%脱氧胆酸钠（国药集团化学试剂有限公司）+0．2%甲硫氧嘧啶（上海复星朝晖药业有限公司）；葱白提取物制剂（由武汉市中西结合医院制剂中心提供，批号：20110902），用色拉油调匀后配置成5 g/L浓度的悬混液。

1.3 实验试剂 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（上海岚派生物科技有限公司），胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）试剂盒（温州东欧生物工程有限公司），ATPase6、ATPase8及内参GAPDH的特异性引物（由上海生工生物工程股份有限公司设计与合成），总RNA提取试剂盒（北京天根生化科技公司），逆转录试剂盒及Real time PCR试剂盒（成都博瑞克生物技术有限公司）。

1.4 实验仪器 DYY-7C电泳仪电源（北京六一仪器厂），ZX6006台式高速离心机（法国Jouan公司）；TS-1型水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；164-5050型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；ABI7500型荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；Gel Doc EQ型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.5 分组与给药 将50只健康雄性SD大鼠随机分笼饲养于SPF级动物房内，温度控制在17～24℃，湿度控制在22%～24%。适应性喂养1周后，随机分为5组，每组10只，除正常组给予普通饲料，其余4组给予高脂饮食，自由进食饮水，造模10周后，低、中、高剂量组分别给予25 mg/（k g·d）、50 mg/（k g·d）、75 mg/（kg·d）葱白提取物灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，除正常组外，期间正常组给予普通饲料，其余4组继续给予高脂饮食，每日1次，连续4周。

1.6 肝脏组织学检查 在肝右叶相同位置距边缘1cm处取适量肝组织，用福尔马林固定24h后做HE染色，在光镜下观察肝组织的病理变化。参照范建高《脂肪性肝病》给肝脏脂肪变性程度进行分级[10]。

1.7 血清中ALT、AST、TC、TG含量的测定 用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后开腹经腹主动脉取血，放置室温20 min后3 500 rpm离心8 min取血清，然后按照试剂盒操作方法步骤通过生化检测仪测定各组大鼠血清中ALT、AST、TC、TG含量。

1.8 Real time PCR检测ATPase6、ATPase8 mRNA的表达 采用Trizol提取RNA后，用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。按试剂盒说明书步骤进行逆转录和扩增反应。PCR引物设计:Rat PGC-1aF:5'-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3，Rat PGC-1aR:5'-GTGTGAGGAGGGTCATC，片段长度 168 bp；βactinF：5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，β-actin R:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'片段长度186bp。PCR反应条件：预变性50℃、2min，95 ℃、10 min；40 个循环中 95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，根据目的产物PGC-1αmRNA和内参照β-actin CT值来反映其相对含量。

1.9 统计方法 采用SPSS23.0统计学软件，数据用均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏组织结构变化 模型组在确认造模是否成功时处死1只，葱白中、高剂量组在造模的过程中各意外死亡1只。与正常组比较，模型组肝脂肪变性明显（P<0.05），与模型组比较，葱白低、中、高剂量组肝脂肪变性均不同程度减轻（P<0.05）；与葱白低剂量组比较，葱白中、高剂量组肝脂肪变性减轻明显（P<0.05），葱白中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，见图1。

表1 各组大鼠肝脂肪变性程度Tab.1 Degree of hepatic steatosisin each group of rats

2.2 各组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平 与正常组比较，模型组血清ALT、AST、TC、TG水平表达明显升高（P<0.05），与模型组比较，葱白低、中、高剂量组血清ALT、AST、TC、TG水平均不同程度降低（P<0.05）；与葱白低剂量组比较，葱白中、高剂量组血清 ALT、AST、TC、TG 水平降低明显（P<0.05），葱白中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肝脏ATPase6、ATPase8 mRNA的表达 与正常组比较，模型组ATPase6、ATPase8mRNA表达明显降低（P<0.05），与模型组比较，葱白低、中、高剂量组ATPase6、ATPase8 mRNA均不同程度升高（P<0.05）；与葱白低剂量组比较，葱白中、高剂量组 ATPase6、ATPase8 mRNA 升高明显（P<0.05），葱白中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

NAFLD的发病机制十分复杂，目前较为公认的是“二次打击”学说。“第一次打击”是指以胰岛素抵抗为基础，TG在肝脏蓄积；“第二次打击”是指氧化磷酸化的激活、呼吸链的损伤导致能量代谢障碍、细胞因子的活化，从而引起肝细胞炎症性坏死[11]。细胞处于氧化应激的状态，细胞内的氧化-抗氧化体系平衡被破坏，肝内活性氧（ROS）的产生超过抗氧化系统的清除能力，导致线粒体损伤[12]。线粒体是细胞能量代谢的中心，是β脂肪酸氧化、三羧酸循环、氧化磷酸化和电子呼吸链传导的场所。实验研究发现[3-4]，采用高脂诱导的NAFLD模型大鼠出现肝线粒体损伤，且肝脏脂肪变程度越重，其线粒体功能损伤越明显。线粒体受损，机体能量产生和储备障碍，这既是脂肪肝的结果，也是导致进一步损伤的重要原因，形成恶性循环。因此，提高与恢复线粒体低剂量能量功能将成为治疗脂肪肝的新方法[13]。

正常情况下，机体通过线粒体电子传递链产生ATP提供机体所需的能量。呼吸链酶在线粒体内膜上，在线粒体电子传递过程中承担电子传递作用。ATP合酶主要有F0和F1两部分组成。其中，F1具有催化ATP合成或水解活性的作用，而F0的主要功能则是构成离子通道，便于质子流通过，对于ATP产生具有导向作用[14]。F0的两个主要亚基由线粒体DNA（mtDNA）ATPase6、ATPase8编码。本次实验结果显示，与正常组相比，模型组ATPase6、ATPase8表达明显减少，给予葱白提取物干预后，低、中、高剂量组ATPase6、ATPase8表达较模型组均升高。ALT的水平反映肝细胞的受损程度，AST可反映线粒体的受损情况。模型组与正常组相比，AST、ALT的表达明显升高，给予葱白提取物干预后，低、中、高剂量组AST、ALT的表达较模型组明显降低。

图1 各组大鼠肝组织结构变化（HE，×400）Fig.1 Hepatic morphologic in each group of rats（H E，×400）

表 2 各组大鼠血清 ALT、AST、TC、TG 水平（x±s）Tab.2 Levelsof serum ALT,AST,TC and TG in each group of rats（x±s）

表3 各组大鼠ATPase6、ATPase8 mRNA的表达（±s）Tab.3 Expression of ATPase6 and ATPase8 mRNA in each group of rats（±s）

表3 各组大鼠ATPase6、ATPase8 mRNA的表达（±s）Tab.3 Expression of ATPase6 and ATPase8 mRNA in each group of rats（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与葱白低剂量组比较，△P<0.05。

分组 动物数 剂量[mg/(kg·d)]ATPase6 mRNA ATPase8 mRNA正常组 10 - 1.00±0.07 1.00±0.08模型组 09 - 0.31±0.04* 0.29±0.07*葱白低剂量组 10 25 0.61±0.08# 0.60±0.06#葱白中剂量组 09 50 0.86±0.06#△ 0.92±0.10#△葱白高剂量组 09 75 0.88±0.04#△ 0.90±0.08#△

中医学认为，NAFLD的发生与“痰”、“瘀”密切相关，痰瘀之邪聚而不散，渐积于肝则痞块乃成，临床上以“祛痰降浊、活血化瘀”为治法，部分患者疗效仍不尽理想，张介眉教授在多年的临床实践中总结出采用“通阳法”来治疗NAFLD取得很好的疗效，为NAFLD的治法提供了另一种思路[15-16]。采用“通阳法”治疗NAFLD的思路来源于清代温病大家叶天士，叶天士指出：“欲除浊阴，急急通阳”，阳气通则痰浊瘀血可除，本清源断而阴浊清。关于葱白的通阳作用，历代医家多有论述，张仲景谓葱白不离于阴，以通阴中之阳，其形态中空，通阳最速。户菲菲等[17-18]在实验中证实葱白提取物可以减少HSC模型大鼠肝组织Ⅳ的过度沉积而起到畅通有形之痰瘀阻塞的作用。从本实验的结果来看，模型组与正常组相比，肝脏出现明显脂肪变性，TC、TG水平明显升高，给予葱白提取物干预后，低、中、高剂量组肝脂肪变性明显减轻，TC、TG水平明显降低。

综上所述，葱白提取物能够改善NAFLD模型大鼠肝脂肪变性，其机制可能与提高ATPase6、ATPase8的表达，改善肝线粒体ATP合成有关。