甲基强的松龙通过下调ERK1/2-NF-κB信号通路减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓炎症

张 健， 曾育琦， 沈 辉， 康德勇， 张 静， 陈晓春

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，是引起中青年人致残的主要原因，其发病机制尚未完全阐明。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)具有与人类MS相似的临床病理及免疫学特征，是模拟MS较好的动物模型。目前认为，致炎性T淋巴细胞介导的免疫反应是MS及EAE的主要发病机制。1型辅助性T细胞(helper T cells，Th1)和Th17细胞及其分泌的细胞因子通过血脑屏障进入中枢神经系统，引起炎症细胞浸润、髓鞘脱失及轴索损害。这一过程涉及多条信号通路。Agrawal等发现，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1)敲除小鼠较野生型小鼠对EAE更易感，临床症状更严重[1]。在MS患者的脑组织及EAE小鼠的脊髓中检测到活化的核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[2-3]。这些研究提示ERK-NF-κB信号通路在EAE的发生和发展中起重要作用。

本研究应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)免疫诱导雌性C57BL/6小鼠，建立EAE模型，待小鼠发病后给予甲基强的松龙(methylprednisol，MP)治疗，在体观察EAE小鼠的临床症状、脊髓病理及炎症介质变化，进一步探索其可能机制，为MP的临床使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 8～10周龄雌性C57BL/6小鼠，购于上海斯莱克实验有限公司[许可证号SCXK(沪)2007-0005，合格证号200700506479]。鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生物工程有限公司合成，采用高效液相色谱仪纯化，HPLC纯度>98%；福氏完全佐剂(complete freund’s adjuvant，CFA)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、罗克沙尔坚牢蓝染料(luxol fast blue，LFB)(美国Sigma公司)；灭活结核杆菌(mycobacterium tuberculosis H37Ra)(美国Difco公司)；MP(大连辉瑞制药公司)；一抗磷酸化ERK1/2，ERK1/2及磷酸化NF-κB，NF-κB(美国Cell Signaling公司)，T-bet和RoRγt(美国Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及动物分组 每只小鼠配制200 μL乳化剂(MOG35-55300 μg，结核杆菌500 μg)，于双侧胁部皮下分4点注射免疫小鼠，每侧2点，每点50 μL乳化液[4]。于免疫当日(0天)及48 h(2 d)腹腔内注射400 ng PT。免疫后每天同一时间点测量小鼠的体质量并进行神经功能评分[5]：无症状为0分；尾部瘫痪为1分；共济失调、后肢轻瘫为2分；双后肢瘫痪为3分；四肢瘫痪为4分；死亡为5分。

将MOG35-55诱导的10～14 d发病且神经功能评分为1～4分的EAE小鼠随机分为溶媒组(腹腔注射PBS 0.1 mL)和MP组(腹腔注射MP 40 mg/kg)，每组9～12只，于每日同一时间(10：30 am)腹腔注射给药，每天1次，共给药7 d；另取9只同龄小鼠作为对照组(Control组)，每日腹腔注射0.1 mL PBS，连续注射7 d。所有小鼠于免疫后第29天处死。

1.2.2组织病理学染色 每组取3只小鼠，经3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将预冷的4%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS(pH=7.2)由左心室内灌注，冰面上快速取小鼠腰膨大，置于预冷的4%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS，4 ℃固定24 h后石蜡包埋，沿脊髓横切面连续切片，行H-E及LFB染色。根据以下评分标准定量炎症情况[6]：无细胞浸润为0分；脊膜细胞浸润为1分；软脊膜少许炎症细胞浸润(1～10个/视野)为2分；软脊膜中等量炎症细胞浸润(11～100个/视野)为3分；大量炎症细胞浸润(>100个/视野)为4分。髓鞘脱失定量采用以下标准[7]：无髓鞘脱失为0分；软脊膜下轻度髓鞘脱失为1分；显著软膜下血管周围脱髓鞘为2分；融合血管周围及血管下脱髓鞘为3分；累及一半以上脊髓范围髓鞘脱失为4分；大片髓鞘脱失延及整个脊髓为5分。每组剩余小鼠经0.1 mmol/L的PBS灌注后，冰上快速分离脊髓，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3透射电镜检查 电镜标本取材后经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定2 d(4 ℃)，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm，醋酸铀、柠檬酸铅各染色5 min，透射电镜(EM 208型，荷兰飞利浦公司)下观察、摄影。

1.2.4实时荧光定量PCR 抽提小鼠脊髓总RNA，逆转录为cDNA，由荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国ABI公司)进行定量检测。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

IFN-γ：

F1：5′-ATGGCTGTTTCTGGCTGTTACT-3′

R1：5′-GGATTTTCATGTCACCATCCTT-3′

IL-17：

F1：5′- GCAATGAAGACCCTGATAGA-3′

R1：5′- TCTTCTCGACCCTGAAAGTGA-3′

IL-4：

F1：5′-GTCCTCACAGCAACGAAGAAC-3′

R1：5′-TGATGCTCTTTAGGCTTTCCA-3′

IL-5：

F1：5′-ACAAGCAATGAGACGATGAGG-3′

R1：5′-CCACGGACAGTTTGATTCTTC-3′

IL-21：

F1：5′-CCATCAAACCCTGGAAACAATA-3′

R1：5′-TCTTTGGGTGTCCTTTTCT CAT-3′

IL-23：

F1：5′-ATCCAGTGTGAAGATGGTTGTG-3′

R1：5′-AGTAGGGAGGTGTGAAGTTGCT-3′

IL-10：

F1：5′-ACAGCCGGGAAGACAATAACT-3′

R1：5′-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3′

T-bet：

F1：5′-CAACCAGCACCAGACAGAGAT-3′

R1：5′-CAAGACCACATCCACAAACATC-3′

RoRγt：

F1：5′-ATGCCAACAACCACACAGTCT-3′

R1：5′-TGAGGAAGTGGGAAAAGTCAA-3′

GAPDH：

F1：5′-CAGTGGCAAAGTGGAGTTGTTG-3′

R1：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′

实时PCR反应体系：2×ROX 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，无RNA酶水7.8 μL。反应条件：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸60 s，进行40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析引物的特异性。用相对定量2-△△Ct法比较各组间炎症因子及转录因子mRNA的相对表达差异。每份标本均重复检测3管，取均值作为目的基因的表达水平。

1.2.5Western-blot测定 脊髓组织经超声裂解后，采用BCA法进行蛋白定量后取50 μg样品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿电转移法将蛋白转移到PVDF膜上，室温下封闭液封闭1 h，将膜移入用封闭液稀释的一抗(pERK1/2，ERK1/2，T-bet，RoRγt，pNF-κB及NF-κB均为1∶1 000稀释)。4 ℃孵育过夜，洗液洗涤，辣根过氧化物酶耦联的IgG二抗(1∶1 000～1∶2 000稀释)反应60～90 min，洗液洗涤，化学发光法显色，X射线底片曝光，actin作为内参照(1∶2 000稀释，英国Abcam公司)。

2 结 果

2.1MP改善EAE小鼠的临床神经功能 重复性方差分析显示，各组间总体主效应——时间(P<0.001)和组别(P<0.01)均有统计学意义，并且存在交互作用(P<0.001，图1)。与溶媒组比较，MP组的临床神经功能评分明显降低，停止腹腔注射MP后，临床症状无复发。

2.2MP减轻EAE小鼠脊髓炎症细胞浸润和髓鞘脱失 对照组小鼠H-E染色显示，脊髓未见炎性细胞；LFB染色显示，蓝色髓鞘排列规则，着色均匀；电镜显示，小鼠脊髓髓鞘板状结构清晰，细胞器结构致密完整。溶媒组小鼠H-E染色见脊髓大量炎症细胞浸润，小血管周围可见血管套形成，动物炎症

图1 小鼠临床神经功能评分Fig 1 Clinical score of mice

评分为(3.24±0.45)分；LFB染色见脊髓白质区有大小不等片状髓鞘脱失，髓鞘纤维松散，空泡形成；髓鞘脱失评分为(3.45±0.30)分；透视电镜可见小鼠髓鞘呈板状剥脱、崩解断裂、空泡形成，轴索肿胀结构疏松。MP组小鼠脊髓炎症细胞较溶媒组明显减少，炎症细胞浸润评分为(1.58±0.43)分；LFB染色显示髓鞘排列较清晰，髓鞘脱失评分为(1.26±0.50)分，髓鞘破坏情况较溶媒组明显减轻，2组比较差别有统计学意义(n=3，P<0.05，图2)。

A1～A3，B1～B3为H-E染色； C1～C3为LFB染色； D1～D3为EM染色. A1，B1，C1，D1：对照组，H-E染色未见炎症细胞，LFB染色见髓鞘结构清晰，电镜下见髓鞘结构清晰，细胞器致密完整；A2，B2，C2，D2：溶媒组，H-E染色见大量炎症细胞浸润，LFB染色见脊髓白质片状髓鞘脱失，电镜下见髓鞘结构紊乱板层脱失；A3，B3，C3，D3：甲基强的松龙组，H-E染色见脊髓炎症细胞较溶媒组明显减少，LFB染色见脊髓白质部分髓鞘结构破坏，电镜下见部分髓鞘结构破坏.图2 EAE鼠脊髓组织病理学改变Fig 2 Histology of spinal cord tissues in EAE-inflicted mice

2.3MP影响EAE模型鼠脊髓细胞因子mRNA表达 实时荧光PCR方法检则结果发现，MP组小鼠脊髓促炎性细胞因子IFN-γ，IL-17，IL-21及IL-23明显下降，分别为溶媒组的33.32%，8.08%，36.03%及48.61%，而抑炎性细胞因子IL-5，IL-4及IL-10明显升高，分别为溶媒组的2.39，5.98及1.77倍，差别具有统计学意义(n=3，P<0.05，图3A)。

2.4MP抑制Th1/Th17特异性谱系转录因子mRNA水平及蛋白表达 与溶媒组比较，MP组Th1细胞特异性谱系转录因子T-bet和Th17细胞特异性转录因子孤核受体RoRγt的mRNA表达，分别下降了68%和52.5%(n=3，P<0.05，图3B)，蛋白水平分别下降了71%和73%(n=3，P<0.05，图4)。

n=3. MP:甲基强的松龙； EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎. A：细胞因子mRNA相对表达量； B：转录因子T-bet和RoRγt mRNA表达量. 与溶媒组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.图3 甲基强的松龙对EAE鼠脊髓细胞因子和转录因子mRNA表达的影响Fig 3 The expression of cytokines and transcription factors mRNA in spinal cords after MP treatment

2.5MP下调EAE模型鼠脊髓ERK1/2及NF-κB蛋白磷酸化水平 溶媒组小鼠较对照组小鼠脊髓pERK1/2和pNF-κB蛋白表达增高，分别为对照组的2.27及2.29倍(n=4，P<0.05，图5)。MP处理后，小鼠脊髓中pERK1/2及pNF-κB明显下降，分别下降了67.5%及61.1%(n=4，P<0.05)。

3 讨 论

MS是一种中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病，其发病机制复杂多样。目前针对MS的治疗主要以减轻患者恶化期的症状、缩短病程、改善残疾程度及防止并发症为主要目标。短期大剂量糖皮质激素治疗可促进MS患者急性发病期的神经功能恢复，但其作用机制仍未完全阐明[8-9]。

n=3. MP:甲基强的松龙； EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎. A：转录因子蛋白印迹图； B：T-bet相对蛋白表达量； C：RoRγt相对蛋白表达量. 与对照组比较，#：P<0.05；与溶媒组比较，☆：P<0.05.图4 甲基强的松龙对EAE鼠脊髓转录因子蛋白表达的影响Fig 4 The expression of cytokines and transcription factors in spinal cords after MP treatment

n=3. MP:甲基强的松龙； EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎. A：pERK1/2及pNF-κB蛋白印迹图； B：pERK1/2相对蛋白表达量； C：pNF-κB相对蛋白表达量. 与对照组比较，#：P<0.05； 与溶媒组比较，☆：P<0.05.图5 甲基强的松龙抑制EAE鼠pERK1/2和pNF-κB蛋白表达Fig 5 MP inhibited the pERK1/2-NF-κB signaling pathway

本研究通过建立MS动物模型——EAE鼠模型，待EAE出现临床症状时，给予人工合成的中效糖皮质激素(MP)治疗，模拟临床急性发病MS患者用药，在体研究MP的可能作用靶点，以期进一步指导临床治疗。研究发现，MP可改善EAE鼠的临床神经功能评分，减轻脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失，7 d后撤除MP，小鼠临床症状未出现复发，提示MP具有减轻炎症反应及髓鞘损伤的作用。

MS最重要的发病机制是免疫失衡[10-11]。目前普遍认为，Th1通过分泌IFN-γ等细胞因子参与MS和EAE的致病过程，而Th2细胞分泌的IL-10及IL-4具有抗炎作用，对MS和EAE的病理发展有保护作用。近年发现一种高度致炎性细胞因子IL-17，主要由Th17细胞分泌，Th17细胞与Th1细胞共同参与EAE发生发展[12-13]。IFN-γ及IL-17协助致炎性T细胞通过血脑屏障进入中枢神经，导致自身免疫反应，募集更多效应细胞，扩大炎症反应，促进淋巴毒素或肿瘤坏死因子等炎质介质释放，引起髓鞘广泛脱失[14-15]。本实验显示，EAE小鼠脊髓的IFN-γ及IL-17明显高于对照组，证实Th1/Th17与EAE病情的严重程度密切相关。小鼠发病后给予MP治疗，脊髓致炎性细胞因子IFN-γ，IL-17，IL-21及IL-23 mRNA表达水平明显降低，抑炎性细胞因子IL-4，IL-5及IL-10 mRNA表达水平升高。同时Th1/Th17细胞特异性谱系转录因子T-bet/RoRγt mRNA及蛋白表达降低。提示MP可能影响EAE小鼠脊髓中T淋巴细胞分化，下调致炎性细胞因子释放，上调抑炎性细胞因子，起免疫调节作用。

本研究中，MOG35-55诱导EAE发病后，小鼠脊髓中pNF-κB及pERK1/2表达显著增高，与小鼠神经功能障碍、脊髓病理损伤密切相关。MP治疗后，pNF-κB及pERK1/2表达明显下降，且与小鼠神经功能及脊髓病理损伤改善一致。因此，推测pERK1/2由胞质转位到核内，进而介导NF-κB等转录因子活化，促进T淋巴细胞活化增殖，参与细胞内多种反应，可能与T细胞相关免疫性疾病的治疗有关。MP对ERK1/2-NF-κB的抑制作用可能是其抗炎的主要机制之一。

综上所述，MP可能通过抑制ERK1/2-NF-κB信号通路，下调Th1/Th17产生的致炎细胞因子，上调Th2产生的抑炎细胞因子，从而改善EAE神经功能评分，减轻脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失。