MEKK3在肾透明细胞癌中的表达和临床价值

黄海鹏， 付伟金， 韦康来， 徐小龙， 陈文元

肾癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的80%，而肾癌中约80%为肾透明细胞癌(clear renal cell carcinoma, CRCC)[1]。目前临床上关于CRCC的治疗虽然取得了一定的成效，但仍缺乏对CRCC所涉及的分子和细胞机制的研究[2]。有研究认为，有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3, MEKK3)可能与恶性肿瘤的发生发展密切相关[1-2]。研究表明，MEKK3在CRCC患者中过表达，提示MEKK3在多种恶性肿瘤包括CRCC的发生发展中可能发挥重要作用[3-4]。为探讨MEKK3的表达情况与CRCC的关系，本研究拟检测CRCC组织中MEKK3的表达，探讨其与CRCC的临床病理特征及预后之间的关系，报道如下。

1 对象与方法

1.1对象 收集2010年1月1日-2016年12月31日实行根治性肾切除术的标本70例，男性43例，女性27例；年龄中位数58岁(34～79岁)。肿瘤部位：左侧34例，右侧36例。根据2010年AJCC推荐的TNM分期系统进行分期，其中Ⅰ期18例，Ⅱ期25例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例。患者均经病理确诊为CRCC，术前均未接受化疗或放疗。同时取30例癌旁正常组织(距离肿瘤边缘≥2 cm)为对照组，男性19例，女性11例；年龄中位数57岁(42～68岁)。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色 取肾癌组织及癌旁正常肾组织各0.2 g，平均分成2份，一份迅速置于-80 ℃低温冰箱保存，提取蛋白行免疫印迹检测；另一份置于10%中性甲醛中固定，行免疫组织化学检测。所有组织均经10%中性甲醛缓冲液固定，常规脱水、浸蜡，石蜡包埋，切片厚度4 μm。采用SP法，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照染色。一抗为MEKK3(美国Abcam公司)，稀释为1∶50，二抗为快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物和二氨基联苯胺(DAB)，均购于福建迈新生物技术有限公司，二甲苯脱蜡，乙醇脱苯，3%的过氧化氢脱内源性过氧化物酶，柠檬酸高压修复法修复，一抗4 ℃冰箱过夜，二抗37%水浴25 min，DAB显色，苏木精复染，封片。

1.2.2免疫印迹法检测MEKK3表达 组织块称质量后，于液氮中研钵粉碎，洗涤离心后取上清。Bradford法检测样品中的蛋白浓度，15%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，兔抗人MEKK3单克隆抗体(美国Abcam公司)孵育过夜，二抗孵育，显色后进行图像分析。从CRCC组织和癌旁正常肾组织各提取4例进行免疫印迹检测。

1.2.3结果判定标准 由2个病理科医师独立双盲评价MEKK3的表达，根据染色指数评价免疫组织化学染色结果，染色指数为染色阳性细胞数和细胞染色强度的乘积：(1)染色阳性细胞数。0(0%～1%)，1(>1%～10%)，2(>10%～50%)，3(>50%～75%)，4(>75%～100%)；(2)细胞染色强度。无染色为0分，弱阳性(浅黄色)为1分，阳性(棕黄色)为2分，强阳性(棕褐色)为3分。MEKK3在CRCC中的表达通过染色指数衡量，≥6分表示MEKK3高表达，<6分则表示MEKK3低表达[3]。

1.2.4随访情况 所有患者均进行随访，中位随访时间为62月(13～88月)，总生存期(overall survival, OS)为手术日期到随访结束，或是因肿瘤复发、转移而死亡的日期。

1.3统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。采用软件X-tile筛选MEKK3免疫组织化学正常表达和过表达的分界值。MEKK3与临床病理参数的相关性应用卡方检验。对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性，预后因素分析采用Cox回归模型。2组计量资料的比较采用独立样本t检验，多组计量资料比较采用方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1MEKK3蛋白在CRCC组织和癌旁正常组织中的表达 免疫组织化学染色结果显示，MEKK3主要表达于胞质和胞膜。70例CRCC组织中，MEKK3蛋白阳性表达50例(71.4%)；30例癌旁正常肾组织中，MEKK3蛋白阳性表达6例(20%)，二者比较差别有统计学意义(P<0.01，图1)。免疫印迹结果显示，CRCC组织中MEKK3蛋白的表达水平高于癌旁正常肾组织，组间比较差别有统计学意义(P<0.01，图2)。

2.2MEKK3与临床参数的关系 卡方检验结果显示，MEKK3表达与性别(P=0.027)、年龄(P=0.007)、肿瘤大小(P=0.004)有关(表1)。

2.3CRCC患者中MEKK3的表达与患者预后的相关性 Kaplan-Meier法结果提示，MEKK3蛋白高表达患者(平均生存期为56月)预后明显低于低表达者(平均生存期为70月)(图3)。单因素Cox回归分析提示，年龄、肿瘤大小、TNM分期、MEKK3表达水平与患者的预后不良密切相关；多因素Cox回归分析显示，年龄、肿瘤大小、TNM分期、MEKK3表达水平是判定CRCC预后的独立因素(表2)。

3 讨 论

CRCC是肾恶性肿瘤最常见的病理类型，早期患者可通过肾癌根治术获得治愈，而晚期患者对化疗及放疗均不敏感，预后不佳[5-7]。靶向治疗目前已成为治疗晚期患者的主要手段[8]，短期客观缓解率可达40%～50%，但长期缓解率低。因此，早期诊断和准确的预后评估对CRCC的诊治具有重要意义，但CRCC的发生机制目前还不清楚。

A，B为MEKK3蛋白在CRCC组织中高表达(SP ×100，200)；C，D为MEKK3蛋白在CRCC组织中表达(SP ×100，200；E，F为MEKK3蛋白在癌旁正常肾组织中低表达(SP ×100，200).图1 免疫组织化学检测MEKK3在CRCC组织与癌旁正常肾组织中的表达Fig 1 Immunohistochemical detection of MEKK3 in CRCC tissue and adjacent normal renal tissue

T为CRCC组织；N为癌旁正常肾组织.图2 免疫印迹检测MEKK3在CRCC组织与癌旁正常肾组织中的表达Fig 2 The expression of MEKK3 in the normal renal tissue of CRCC tissue and carcinoma

图3 MEKK3表达与生存曲线的关系Fig 3 The relationship between MEKK3 expression and survival curve

表1MEKK3表达与肾透明细胞癌患者临床参数的关系

Tab1The relationship between MEKK3 expression and clinicopathologic features of renal clear cell carcinoma

临床参数nMEKK3的表达高表达(n=32)低表达(n=38)χ2P性别4.9170.027 男452520 女25718年龄/岁7.3890.007 ≤60452619 >6025619肿瘤大小/cm8.2890.004 ≤7352213 >7351025淋巴结转移1.7890.181 N0592930 N1-21138TNM分期0.4380.508 Ⅰ～Ⅱ432122 Ⅲ～Ⅳ271116

表2肾透明细胞癌患者预后的单因素与多因素分析

Tab2Single factor and multivariate analysis of prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

临床参数单因素分析HR(95% CI)P多因素分析HR(95% CI)P性别0.109 男,女1.43(1.230,1.880)年龄/岁0.0010.003 ≤60 >600.355(0.186,0.680)0.154(0.045,0.522)肿瘤大小/cm0.0190.031 >7 ≤71.478(1.258,1.884)2.824(1.099,7.258)淋巴结转移0.273 N1-2 ,N00.649(0.299,1.406)TNM分期0.036<0.001 T3-4,T1-21.947(1.046,3.626)36.527(13.176,101.260)MEKK3表达0.0060.030 高,低2.408(1.291,4.490)2.128(1.076,4.208)

遗传与基因变异可激活相关肿瘤信号通路，与恶性肿瘤的发生密切相关[9-10]。MEK/ERK信号通路可被相关生长因子或原癌基因突变后激活，参与调控包括CRCC在内的多种癌细胞信号通路，而MEKK3是一种重要的蛋白激酶，可有效激活MEK/ERK信号通路，ERK磷酸化后可激活调控细胞增殖和生存的相关基因的转录因子[11]。目前，关于MEKK3的表达与癌症关系的研究中，刘平等研究显示，宫颈上皮内瘤变组织的MEKK3表达水平明显高于慢性宫颈炎组织；刘健等研究显示，MEKK3蛋白在前列腺癌组织中的表达明显高于前列腺增生组织[12-13]。国外研究也显示，MEKK3在乳腺癌、宫颈癌等存在过表达[14-15]。本研究也显示，MEKK3在CRCC组织中存在过表达，与Lu等和Qi等研究相一致[3-4]，提示MEKK3在CRCC的发生发展中可能发挥重要作用。本研究结果还显示，MEKK3表达与性别、年龄、肿瘤大小有关，提示男性肾癌患者MEKK3表达阳性率更高，可能有助于男性CRCC的筛查；≤60岁的CRCC患者MEKK3表达阳性率更高，可能有助于相对年轻患者的筛查，但其具体机制仍需进一步分析。另外，Kaplan-Meier法结果显示，MEKK3蛋白高表达患者的生存时间明显低于低表达者；单因素Cox回归分析提示，年龄、肿瘤大小、TNM分期、MEKK3表达水平与患者的预后不良密切相关；多因素Cox回归分析显示，年龄、肿瘤大小、TNM分期、MEKK3表达水平是判定CRCC预后的独立因素，提示相对于MEKK3蛋白低表达患者，高表达患者的预后更差，MEKK3蛋白表达是预后的独立因素。Lu等利用RNA技术干扰肾癌细胞株中MEKK3蛋白后，引起肾癌细胞凋亡[3]，提示MEKK3过表达可能与肿瘤细胞凋亡失衡有关，抑制MEKK3蛋白有可能成为治疗CRCC的新方法。

综上所述，MEKK3的表达与CRCC的发生、发展和预后密切相关，提示MEKK3可能是MEK/ERK信号转导通路中的重要调节蛋白，与肿瘤细胞的增殖和肿瘤转移密切相关，并可能作为一个重要的CRCC预后评估标志物，靶向治疗MEKK3可能为晚期CRCC治疗提供新策略。另外，后续研究应进一步扩大样本量，并增加其他检测指标，以期为临床诊断、治疗CRCC提供更多、更可靠的依据。