局部晚期鼻咽癌患者外周血淋巴细胞亚群与预后的相关性

努热古·阿热甫， 韩 潇， 胡云辉

(1新疆医科大学第三临床医学院(附属肿瘤医院)头颈放疗科， 乌鲁木齐 830011;2中国医学科学院肿瘤免疫与放射治疗研究实验室, 乌鲁木齐 830011)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是头颈部常见恶性肿瘤，其发病率在20～30/10万，但70%的新发病例已经为Ⅲ期和ⅣA期，被称为局部晚期NPC[1]。而且，即使经过合理的放射治疗和规范的综合治疗，局部晚期NPC患者仍有较高复发、转移率[2-3]。同时，NPC初治治疗失败后，预后往往不佳，而再程治疗的最佳方案仍没有较统一的定论。因此，需开辟新的治疗途径进一步提高初治NPC的治疗疗效。

在抗肿瘤免疫应答中，T细胞及NK细胞发挥了着重要的作用[4]。有研究证实，NPC患者外周血中CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T和B细胞比例均较健康人群下降，而CD8+T、NK细胞比例均较高，提示免疫机制参与了鼻咽癌的发生[5]。Hsiao等[6]研究发现NPC患者外周血中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和可溶性白介素-2受体(soluble interleukin-2 receptor, sIL-2)水平较健康群人明显升高，且在治疗后复发的患者中，上述指标也再次出现升高。因此，在NPC发生发展的过程中伴随着免疫细胞功能和数量的动态变化。

为进一步明确淋巴细胞亚群在鼻咽癌预后中指导作用，本研究通过流式细胞术检测新疆医科大学附属肿瘤医院收治的NPC患者外周血淋巴细胞亚群所占比例，以探讨淋巴细胞亚群比例与局部晚期NPC患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1临床资料收集2013年1月-2018年2月在新疆医科大学附属肿瘤医院就诊，经病理确诊的NPC患者88例，其中男性65例，女性23 例；年龄14～84岁，中位年龄46岁。参考1997年WHO对吸烟者定义为一生中连续或累计吸烟≥6个月者标准，其中吸烟者25例，非吸烟者63例。存在肿瘤家族史16例，无肿瘤家族史72例。参考AJCC/UICC第八版NPC分期标准，其中Ⅲ期(T3N0～2M0，T1～2N2M0)47例，ⅣA(T4N0～3M0，T1～3N3M0)期41例。纳入标准：首次经病理明确诊断并未行治疗的NPC；KPS评分≥70分；有完整的初始临床病例资料；无放化疗禁忌证；无免疫系统疾病及既往未行免疫治疗者；无活动期结核、乙肝、丙肝、艾滋病等传染性疾病或急性感染性疾病。该研究获得新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查通过，患者及其家属知情并签署知情同意书。排除标准：临床分期为Ⅰ、Ⅱ、ⅣB期；未完成规范化放化疗疗程。

1.2标本采集采集NPC患者治疗前的肘静脉血标本10 mL(EDTA抗凝)。标本送我院检验科，经离心机分离获得外周血单个核细胞，并用于流式细胞术检测外周血CD3+T细胞比例、CD4+T细胞比例、CD8+T细胞比例、B细胞比例和NK细胞比例，同时计算CD4+/CD8+。

1.3治疗方法放疗：NPC患者均采用三维适形调强放疗(intensity-modulated radiation therapy, IMRT)技术，9个共面射野。给予头颈肩面罩固定。Philips MX8000大孔径螺旋CT从头顶至锁骨下3 cm增强扫描，层距3 mm。完成扫描后将扫描图像经网络系统传输至治疗计划系统。靶区勾画参照ICRU50号和62号报告标准，勾画靶区及危及器官。化疗：NPC患者均接受了以多西他赛75 mg/m2+顺铂75 mg/m2q3 w方案为主的诱导化疗2个周期。在诱导化疗后给予单药顺铂30 mg/m2qw同步放化疗。

1.4随访治疗结束后即进行随访，治疗后2 a内每3个月随访1次，治疗后3～5 a内每6个月随访1次，随访方式包括住院复查、门诊复查。通过随访了解患者生存状态，是否存在局部复发和/或远处转移。

2 结果

2.1外周血淋巴细胞亚群在不同临床特征中的比较经两独立样本的t检验或t′检验，在≤50岁组外周血CD3+T细胞比例为(63.097±12.471)，而在>50岁组外周血CD3+T细胞比例为(69.812±10.364)，差异有统计学意义(P=0.007)；在N0～N1组外周血CD3+T细胞比例为(59.123±13.902)，而在N2～N3组CD3+T细胞比例为(67.859±11.235)，差异有统计学意义(P=0.043)。在≤50岁组外周血NK细胞比例为(20.157±11.026)，而在>50岁组外周血NK细胞比例为(15.205±8.396)，差异有统计学意义(P=0.026)。外周血CD4+T细胞比例、CD8+T细胞比例、CD4+/CD8+、B细胞比例在不同性别、年龄、吸烟史、家族史、T分期、N分期、临床分期等临床特征的比较中，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1、表2)。

表1 外周血T细胞亚群比例在不同临床特征中的比较

2.2局部晚期鼻咽癌的随访分析全组共88例局部晚期鼻咽癌患者，中位随访时间31.68个月，其中失访2例，失访率2.27%。主要观察终点为OS，次要观察终点为PFS、LRFS、MDFS，出现主要终点事件13例，其中2例为非肿瘤相关性死亡。经Kaplan-Meier分析，5 a OS率为81.78%，5 a PFS率为76.51%，5 a LRFS率为90.51%，5 a MDFS率为80.09%(图1)。

a: 5 a OS

b: 5 a PFS

c: 5 a LRFS

d: 5 a MDFS

图1 局部晚期鼻咽癌的5 a随访分析

2.3外周血淋巴细胞亚群预测局部晚期鼻咽癌的ROC分析经ROC分析，选取曲线下最大面积所对应的数值，CD8+T细胞(图2a)、NK细胞(图2b)分别以35%、13%作为界值预测OS、PFS、LRFS、MDFS的准确度最高。故根据CD8+T细胞比例将全组分为CD8+T细胞低比例组和CD8+T细胞高比例组，同理根据NK细胞比例将全组分为NK细胞低比例组和NK细胞高比例组。

2.4外周血淋巴细胞亚群在局部晚期鼻咽癌中的单因素分析采用Log-rank法单因素分析CD8+T细胞比例在预后中价值，在CD8+T细胞低比例组5 a LRFS率为84.93%，而在CD8+T细胞高比例组5 a LRFS率为100.00%，HR=5.082(1.221～21.150)，且差异有统计学意义(P=0.026)。但是5 a OS率、5 a PFS率、5 a MDFS率在CD8+T细胞低比例组和CD8+T细胞高比例组的比较中，差异均无统计学意义(P>0.05)(图3)。

a: CD8+T细胞

b: NK细胞

图2ROC曲线

采用Log-rank法单因素分析NK细胞比例在预后中价值，5 a OS率、5 a PFS率、5 a LRFS率、5 a MDFS率在NK细胞低比例组与NK细胞高比例组的比较中，差异均无统计学意义(P>0.05)(图4)。

2.5外周血淋巴细胞亚群在局部晚期鼻咽癌中的多因素分析经COX回归分析，年龄(P=0.023)、CD8+T细胞比例(P=0.013)是局部晚期鼻咽癌5 a OS的影响因素；CD8+T细胞比例(P=0.030)是局部晚期鼻咽癌5 a PFS的独立影响因素(表2～表5)。

a: 5 a OS

b: 5 a PFS

c: 5 a LRFS

d: 5 a MDFS

图3CD8+T细胞比例在局部晚期鼻咽癌中的单因素分析

a: 5 a OS

b: 5 a PFS

c: 5 a LRFS

d: 5 a MDFS

图4 NK细胞比例在局部晚期鼻咽癌中的单因素分析

表3 局部晚期鼻咽癌5 a PFS的多因素分析

表4 局部晚期鼻咽癌5 a LRFS的多因素分析

表5 局部晚期鼻咽癌5 a MDFS的多因素分析

3 讨论

T细胞亚群中CD8+T细胞是抗肿瘤的主要效应细胞[7]，CD4+T细胞分泌细胞因子辅助诱导和激活CD8+T细胞，二者在肿瘤免疫中处于动态平衡。固有免疫中的NK细胞也参与了机体的抗肿瘤。同时，肿瘤细胞也可以通过分泌细胞因子等途径诱导免疫细胞凋亡、抑制免疫细胞活化与增值，也可通过诱导调节性T细胞抑制免疫应答[8]。本研究发现，局部晚期NPC患者不同年龄阶段，CD3+T细胞比例和NK细胞比例存在差异，而不同N分期之间CD3+T细胞比例也不同，提示不同的临床特征可能对淋巴细胞亚群的比例存在一定程度的影响。

最新的一项研究显示，7 251例经IMRT治疗的鼻咽癌患者5 a OS率为86.9%[9]。本研究鼻咽癌全组5 a OS率为81.78%，5 a PFS率为76.51%，5 a LRFS率为90.51%，5 a MDFS率为80.09%，与其结果基本相似。

Hsu等[10]阐述了CD8+T细胞比例与较差的OS，PFS，LRFS明显相关，多因素分析进一步提示CD8+T细胞比例是死亡，治疗失败和局部复发的独立预后因素。本研究结果提示在单因素分析中，在CD8+T细胞比例≤35%的局部晚期NPC患者中，5 a LRFS率为84.93%，而在CD8+T细胞比例>35%的局部晚期NPC患者中，5 a LRFS率为100.00%，明显高于CD8+T细胞比例≤35%的局部晚期NPC患者，并且CD8+T细胞比例≤35%的局部晚期NPC患者5 a之内发生局部复发的风险是CD8+T细胞比例>35%的局部晚期NPC患者的5.082倍。与此同时，5 a OS率、5 a PFS率在CD8+T细胞比例≤35%组均低于CD8+T细胞比例>35%组，差异有一定统计学趋势。在多因素分析中，CD8+T细胞比例与年龄均为5 a OS的影响因素，但是CD8+T细胞比例越高，患者发生的死亡风险越低，并且在5 a PFS的分析中，CD8+T细胞比例是其独立预后影响因素，局部晚期NPC患者复发的风险与CD8+T细胞比例呈负相关。不仅如此，CD8+T细胞比例对5 a LRFS的影响也有一定统计学趋势，有待于进一步扩大样本量进行分析。

Lu等[11]评估了197例鼻咽癌的外周血淋巴分类，提示较高的NK细胞比例可以获得较好的OS和PFS，并且是影响局部复发及远传转移的重要因素。在本研究中，虽然单因素分析NK细胞比例与5 a OS、5 a PFS、5 a LRFS、5 a MDFS均无明显相关，但是多因素分析提示NK细胞比例在5 a OS(P=0.061)、5 a PFS(P=0.066)、5 a MDFS(P=0.069)中均有一定程度的影响，且NK细胞比例越高，发生死亡，复发和转移的风险越低，与CD8+T细胞比例呈现相似性，值得进一步研究。

综上所述，通过抽取局部晚期NPC患者少量的外周血进行流式分析，获取外周血淋巴细胞亚群的比例，可以对局部晚期NPC的预后有一定预测价值，尤其是CD8+T细胞比例是局部晚期鼻咽癌5 a OS和5 a PFS的影响因素。同时，借助于先进的流式细胞术，可以对各淋巴细胞表面的分子标记进行分析，从而进一步揭示免疫机制在NPC发生发展中的影响，为今后的免疫治疗在NPC的开展提供依据。