磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和肝细胞石蜡抗原对原发性肝癌的诊断价值研究

杨 瑞, 戴光荣, 陈延平, 白金娥

(1延安市人民医院肿瘤科， 2延安市延安大学附属医院内科， 陕西 延安 716000)

原发性肝癌为临床常见的消化系统恶性肿瘤，与我国乙型、丙型肝炎高发有密切关系[1]。由于原发性肝癌预后极差，确诊后中位生存期只有2.5个月[2]，早期准确诊断是治疗的关键，尤其是对转移性肿瘤的鉴别诊断，目前主要借助辅助影像学和肿瘤标记物[3]。原发性肝癌根据病理机制分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)、混合型肝细胞-胆管细胞癌(combined hepatocellular and cholangiocarcinoma, CHC)，将HCC与其他类型分开干预对原发性肝癌预后有重要作用。目前临床上常用的标记物包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3, GPC-3)、精氨酸酶-1(Arginase-1)、甲胎蛋白(AFP)和肝细胞石蜡抗原(hepatocyte paraffin antigen, HepPar-1)等，但既往的研究结果并不一致，有研究认为GPC-3是最敏感的标记物[4]，也有研究发现HepPar-1对诊断和预后的效果最好[5]。为进一步比较GPC-3和HepPar-1对HCC的诊断敏感性、特异性，本研究纳入部分患者进行对比分析，现报道如下。

1 资料和方法

1.1一般资料本研究为横断面调查，选择2012年1月-2016年12月在延安市延安大学附属医院就诊的肝癌患者，入选标准：(1)年龄30～70岁，性别不限；(2)因肝脏新生物就诊，病理学确诊为恶性肿瘤；(3)病理组织充足，能真实反映病变程度和范围；(4)了解研究内容并自愿签署知情同意书。排除标准：(1)合并肝脓肿、血管瘤、寄生虫病等肝脏疾病；(2)组织活检或术前已经进行过化疗或靶向治疗者；(3)肝脏恶性肿瘤复发者；(4)已合并肝外组织转移者。符合入组标准的患者73例。

1.2检测方法所有选取标本经4%中性甲醛固定，常规脱水、包埋、制片。免疫组织化学采用Elivision法(福州迈新生物技术开发有限公司生产，产品编号：2016L0034)，人抗GPC-3(Biomosaics生产)、HepPar-1(Dako丹麦)等试剂，操作严格按产品说明书进行，GPC-3和HepPar-1分别按1∶500、1∶50比例稀释，阳性对照包括胎盘和正常肝细胞组织，均按说明书进行胞浆染色。

1.3判断标准病理组织中超过10%的肿瘤细胞膜或细胞质存在GPC-3着色可视为GPC-3阳性，每一块切片均缺乏GPC-3着色则为GPC-3阴性；超过10%的肿瘤细胞出现Hep Par-1着色则为Her Par-1阳性，所有组织均无着色为Her Par-1阴性[6]。病理科完成肝脏组织切片制作，每张病理切片由2名高年资病理科医师阅片。HCC病例进行Ⅰ～Ⅳ级组织学分级，Ⅰ级是指少量肿瘤细胞分布在肝小梁周边；Ⅱ级是指肿瘤细胞体积更大，同时伴有异型核和腺体结构；Ⅲ级是指细胞核体积和染色体数量均大于Ⅱ级，细胞质呈嗜酸性、颗粒状，但程度低于Ⅱ级；Ⅳ级时肿瘤细胞极少分化，染色体数量增加和小梁组织缺失更加明显。对于诊断有异议时组织多方及外院会诊。

2 结果

2.1一般结果共73例患者因原发或继发性肝癌入组，其中男性52例(71.23%)，女性21例(28.77%)；年龄47～70岁，平均年龄(59.14±9.48)岁；28例HCC(38.36%)，5例ICC(6.85%)；转移性肝癌40例(54.79%)，包括消化系统来源29例(39.73%)，非消化系统6例(8.22%)，不明来源5例(6.85%)，结果见表1。

2.2标记物阳性分布29例Hep Par-1(+)患者中25例为HCC，4例为非HCC(分别为结肠癌和胃癌转移)，Hep Par-1阳性率组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；24例GPC-3(+)患者中19例为HCC病例，5例非HCC(分别为ICC、胃癌和未知来源)，GPC-3阳性率组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。Hep Par-1的敏感度和特异度分别为91.50%和89.21%，GPC-3为78.32%和94.07%。

表1 肝癌组织来源及标记物阳性分布/例(%)

2.3不同病例标记物阳性情况25例HCC病例中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为10、12、6例，无Ⅳ级病例。Ⅰ级病例中Hep Par-1、GPC-3阳性率分别为90.00%和60.00%(χ2=2.400，P=0.121)，Ⅱ级为83.33%和75.00%(χ2=0.253，P=0.615)，Ⅲ级为100%和66.67%(χ2=2.400，P=0.121)，见表2。

表2 HCC病理分级与标记物阳性率关系/例(%)

3 讨论

原发性肝癌的病理生理学进展相对缓慢，基本上都经历了病毒性肝炎、肝硬化、异型增生结节到细胞恶变的过程，早期通常缺乏特异性临床表现，但恶变组织一旦形成病情发展极为迅速。同时原发性肝癌起病隐匿，大部分患者发现时已到晚期而失去手术根治的机会，因此早期诊断对肝癌患者的预后起关键作用[7]。AFP在生殖系统畸胎瘤、转移性肿瘤、妊娠期、病毒性肝炎、肝硬化等情况均可呈假阳性，对原发性肝癌的诊断敏感度只有40%～60%，故AFP不属于特异性检测标记物，尤其是无法区分肝硬化小结节与早期肝癌[8]。同时由于肝组织有两套血供系统，发病早期即可见血行转移，实际病情远超影像学检查所示[9]，因此目前临床常用的影像学联合AFP方案对原发性肝癌诊断敏感性、特异性满意度欠佳均不高，漏诊和误诊现象时常发生,寻找新的、敏感度及特异度较高的原发性标志物成为当前研究热点。

1993年GPC-3首次被人类发现[10]，学界将其列入硫酸类肝素糖蛋白聚糖家族。GPC-3通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosi-tol, GPI)结合于靶细胞表面，介导多种胞内信号传导通路，通过多聚阴离子GAG侧链或核心蛋白、胰岛素样生长因子-Ⅱ等多种细胞因子产生生理学效应，诱导肝细胞分化与增殖而参与肝细胞的恶变[11]。基础研究还发现GPC-3可通过旁分泌或自分泌增强Wnt基因信号来诱导体内和体外HCC肿瘤细胞的生长，在肝细胞的恶变和繁殖发挥着特殊作用[12]。GPC3在肝癌患者尤其是小肝癌患者及AFP阴性的肝癌患者中有着较高的敏感度和特异度，是目前发现的在AFP阴性肝癌中表达较高的基因，因此GPC3在肝癌的早期诊断方面临床意义重大，联合检测GPC3和AFP可望提高肝癌的早期诊断率。有研究认为，GPC-3在原发性肝癌组织中特异性高表达，在肝外组织较少表达，偶见于卵巢癌、肺鳞癌、乳腺癌及部分生殖系统肿瘤等[13]，本研究中无非消化系统肿瘤表达，因此在肝癌的诊断与鉴别诊断方面有重要的临床价值，对判断原发性肝癌早期的血行播散和肝外转移有重要价值，术后随访外周血GPC3水平还有助于判断预后、复发等情况，有望成为判断肝癌细胞血行微转移的一项新型指标。Hep-Par-1是德国学者以石蜡包埋肝脏组织为抗原克隆出的一种新型单克隆抗体，属于线粒体相关抗原[14]。Hep-Par-1是进化上比较保守的一种蛋白，肝细胞在癌变过程中该蛋白仍有程度不同的保留，不仅不与正常胆管上皮细胞无交叉反应，而且未见与除正常肝细胞、癌旁肝细胞和肝细胞、癌旁肝细胞以外的任何实质和间质细胞发生交叉反应。后期的研究发现Hep-Par-1对鉴别HCC、肝内ICC和转移性肝癌有非常重要的作用，其敏感性及特异性均达到90%以上[15]。Hep Par-1偶可见肝外表达(主要为消化道肿瘤)，国内研究通过免疫组化检测发现Hep Par-1在胃癌中表达率达55.4%[16]，而其他肿瘤偶见表达，同样，本研究中非ICC的Hep Par-1阳性病例均来源于消化系统。

考虑到既往研究对GPC-3和Hep Par-1的诊断效果有一定冲突，本研究的主要目的是进一步比较两者对HCC的诊断效能，结果表明Hep Par-1对HCC的敏感度、特异度分别为91.50%和89.21%，与同类研究中敏感度、特异度为83.3%和96.6%相似[17]。而GPC-3在HCC组阳性率为67.86%，非HCC组为11.11%(包括1例ICC、3例胃癌肝转移和1例不明来源肝转移腺癌)。Yao等[18]的研究也表明GPC3在非HCC病例中阳性率较低，ICC病例中只有13%为阳性，但Vanoli等[19]也认为Hep Par-1在HCC的表达率为81%，低于GPC3的91%。本研究中GPC-3和Her Par-1在大多数HCC患者均有表达，同时敏感度和特异度均较高，而非HCC病例中两种标记物表达偏低或为阴性，表明两者均适合用于区分HCC、ICC和其他转移性肝癌，与国内外研究基本一致。同时本研究中GPC-3的特异度高于Hep Par-1(94.07% vs 89.21%)，而敏感度低于Hep Par-1(78.32% vs 94.07%)。因此笔者认为Hep Par-1和GPC-3的诊断效能各有所长，临床上可结合进行判断。

使用不同来源的Her Par-1抗体均表明Her Par-1在诊断HCC的敏感性、特异性基本一致，以肝脏细针穿刺活检组织为样本的检测研究中，GPC-3只在HCC病例表达。笔者认为上述研究与本研究结果差异的原因是取样的方法不同，细针穿刺活检取样获得的样本数量较少，肿瘤细胞密度较低而造成结果偏倚[20]。目前学界对Her Par-1、GPC-3表达率与肿瘤分级的相关性争议较大，本研究中19例Hep Par-1阳性为HCC低分化病例(即Ⅰ、Ⅱ级)，但既往的研究认为Hep par-1阴性与HCC高分化相关，可能与抽样误差相关。大部分GPC-3阳性的HCC病例为低分化，与既往研究中GPC-3和HCC低分化相关的结果一致[2]。

综上所述，GPC-3是诊断HCC的敏感指标，但敏感度不如Hep Par-1，因此两者联合应有助于提高HCC的确诊率。