黄芪提取物对大鼠颈动脉粥样硬化斑块及血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 的影响*

周凤军 付 鹏 张 鑫 牛荣荣 刘 娜 王鸿章 王玲玲

（河北省邯郸市中医院，河北 邯郸 056001）

近年来，我国心脑血管疾病发病率逐年升高。颈动脉粥样硬化是颈动脉血管的一种动态的、持续性、进展性的病理性病变，其常见的病理变化为颈动脉内膜增厚和粥样物质斑块的形成［1-2］。血清基质细胞衍生因子-1（SDF-1）是由骨髓细胞产生的一种趋化蛋白，对单核细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、白细胞的迁移具有明显诱导作用。趋化因子受体-4（CXCR4）是SDF-1的受体，与SDF-1结合后形成同源二聚体，刺激平滑肌细胞增殖并向内膜下迁移，进而损伤内皮细胞，暴露胶原组织，诱导血小板聚集和活化，加剧动脉粥样硬化［3-4］。血管内皮生长因子（VEGF）具有促进细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖的作用，与动脉粥样硬化密切相关［5］。黄芪提取物有效成分为黄芪甲苷，黄芪多糖等，具有破血行瘀。益气养阴、舒张外周血管阻力的功效［6］。本研究拟探讨黄芪提取物对大鼠颈动脉粥样硬化斑块及血清SDF-1、CXCR4、VEGF的影响，为颈动脉粥样硬化的治疗提供理论及临床依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠120只，12周龄，体质量（117.79±10.23）g，许可证号：SCXK（渝）2014-0002。由重庆医科大学动物实验中心提供。

1.2 试药与仪器 黄芪（河北产，批号：07124018），制作工艺为：黄芪适度粉碎。按1∶20料液比加入70%乙醇浸泡24 h，70℃水浴加热回流提取，每次加热2 h，共4次。提取液趁热过滤，药渣按1∶20料液比加入蒸馏水，加热2 h，提取温度保持在70℃，回流提取4次，最后将提取液合并浓缩，每克黄芪提取物浓缩液相当于生药5.14 g。将浓缩液溶入蒸馏水，根据成人剂量公式换算，大鼠用药量为成人的20.13倍，以10.0 mL/kg体质量灌胃，将药液浓度配制成为10.0 g/mL。SDF-1、CXCR4、VEGF Elisa 试剂盒（批号：KIT130986-4、KIT132097-4、KIT109871-2）购于上海广锐生物科技有限公司，北京普天多功能酶标仪PT-3502A，SD-1700彩色超声仪、奥林巴斯全自动生化仪AU-480。

1.3 分组与造模 根据体质量随机分成6组：对照组、模型组、阿托伐他汀组、黄芪提取物高剂量组（8.0 mg/kg）、黄芪提取物中剂量组（4.0 mg/kg）、黄芪提取物低剂量组（2.0 mg/kg），每组20只，雌雄各半，饲养环境符合SPF级实验条件要求。动物自由摄取饲料、自由饮水，自动控制昼夜循环（12/12 h），室温（22±1）℃。每周称质量1次，每周调换笼位1次。模型组、阿托伐他汀组、黄芪提取物各剂量组：实验前10周，予以各组大鼠高脂饲料（70%基础饲料，10%蛋黄、13%猪油、1%胆固醇、2%3号胆盐酸、1%丙硫氧嘧啶、3%吐温-80℃）喂养，并一次性腹腔注射维生素D3注射液60万U/kg。对照组喂以普通饲料。各组给药方法：根据预试验获得大鼠黄芪提取物的药物半数有效量（ED）约为320.0 mg/kg，取大鼠黄芪提取物ED的1/4（80.0 mg/kg）、1/8（40.0 mg/kg）、1/16（20.0 mg/kg）作为黄芪提取物高剂量组、黄芪提取物中剂量组、黄芪提取物低剂量组，连续灌胃8周，每周记录体质量，调节并维持给药量；阿托伐他汀组给予等体积的阿托伐他汀注射液灌胃（30.0 mg/kg），对照组给以同等体积的蒸馏水灌胃，干预8周。

1.4 标本采集与检测 1）实验结束后，仰卧位固定大鼠于平板上，SD-1700彩色超声仪测量颈动脉血管内膜（IMT）、颈动脉血管中膜（MT），颈部侧伸 45°，取颈动脉长轴切面，测量颈总动脉、颈内和颈外动脉起始端管腔内膜交界面到内膜与外膜交界处之间的垂直距离，位置为双侧颈总动脉、颈动脉分叉处，连续测量3个心动周期，取其平均值为IMT、MT。2）股动脉取血5 mL置于无菌非抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，奥林巴斯AU-480测定血清三酰甘油（TAG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。3）多功能酶标仪PT-3502A检测 SDF-1、CX-CR4、VEGF水平，具体方法为：取100 μL血清加入到相应的微孔中，在37℃孵育2 h，每孔中100 μL的检测抗体稀释液（绿色），用胶带密封微孔板后37℃孵育1 h，漂洗微孔，加入酶标抗体：每孔加入100 μL的辣根过氧化物酶标抗体稀释液（红色），用胶带密封微孔板后37℃孵育30 min，重复漂洗操作过程。加入100 μL底物液（分别含 SDF-1、CX-CR4、VEGF） 在 37℃放置10 min，每孔加入终止液 100 μL（2 M H2SO4）终止反应，于 450、465、492 nm 检测 OD 值。4）处死大鼠后，手术切取双侧颈内动脉2 cm处，常作HE染色观察病理变化。具体方法：石蜡包块与二甲苯中脱蜡5～10 min，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10 min，无水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min。制作5 μm切片，制作好的切片于苏木素染色液5 min，浸自来水中冲洗去多余的染色液，10 min后，蒸馏水再洗涤1遍，95%乙醇5 s，伊红染色液染色1 min。5）三色（MASSON）染色测定股动脉胶原面积（CA）、血管横截面积（CVA），具体方法为：常规制作 5 μm 切片，将制作好的切片规脱蜡至蒸馏水，置于丽春红酸性品红液中染2 min，放入0.2%冰醋酸水溶液2 min，放入5%磷铝酸水溶液酶染2 min，放入0.2%冰醋酸水溶液洗2 min，甲基绿染色3 min，自来水冲洗，95%酒精分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 统计学处理 应用Epidata、SPSS19.0统计软件。TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF、IMT、MT、CA、CVA以（±s）表示，分析前进行正态检验，若满足正态性，采用LSD-t两两检验，若不满足正态性，数据转换后行LSD-t两两检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TAG、TC、LDL-C水平的比较 见表1。与对照组比较，黄芪提取物各剂量组TAG、TC、LDL-C水平升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪提取物各剂量组TAG、TC、LDL-C降低，且剂量-效应关系明显（P<0.05）；与阿托伐他汀组相比，黄芪提取物组低、中剂量组 TAG、TC、LDL-C 明显升高 （P<0.05）。

表1 各组大鼠血清 TAG、TC、LDL-C 水平的比较（mmoL/L，±s）

表1 各组大鼠血清 TAG、TC、LDL-C 水平的比较（mmoL/L，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与阿托伐他汀组比较，◇P＜0.05，下同

组别 n L D L-C对照组 2 0 2.4 6±0.3 1模型组 2 0 3.7 5±0.3 7阿托伐他汀组 2 0 2.5 0±0.3 0 T A G T C 0.7 3±0.1 2 2.1 3±0 1 5 1.1 4±0.1 3 8.6 6±0.4 7 0.7 6±0.1 2 2.3 4±0.1 4黄芪低剂量组 2 0 3.3 5±0.3 1*△◇1.0 3±0.1 2*△◇ 6.1 4±0.3 4*△◇黄芪中剂量组 2 0 0.9 2±0.0 9*△◇ 4.2 3±0.2 3*△◇ 2.9 1±0.2 6*△◇黄芪高剂量组 2 0 0.7 7±0.1 0△ 2.3 5±0.1 6△ 2.5 1±0.3 0△

2.2 各组大鼠颈动脉HE染色结果比较 见图1。对照组颈脉管壁3层结构清晰，内皮细胞结构连续完整，平滑肌细胞呈梭形，排列整齐；模型组颈脉管壁3层结构混乱，内膜增厚粗糙，内皮细胞不连续，见大量巨噬细胞、泡沫细胞，平滑肌细胞明显增生，排列紊乱；黄芪提取物组低剂量组颈动脉病理改变同模型组，无明显改善；黄芪提取物组中、高剂量组可见较为清晰的3层结构颈脉管壁，颈脉管内膜增厚减轻，内皮细胞结构趋于完整，可见少量巨噬细胞、泡沫细胞，平滑肌细胞排列整齐；阿托伐他汀组颈动脉病理改变基本正常。

图1 各组大鼠颈动脉HE染色结果（200倍）

2.3 各组大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF水平的比较 见表2。与对照组比较，黄芪提取物各剂量组SDF-1、CXCR4、VEGF 水平升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪提取物各剂量组SDF-1、CXCR4、VEGF降低，且剂量-效应关系明显（P<0.05）；与阿托伐他汀组比较，黄芪提取物组低、中剂量组SDF-1、CXCR4、VEGF明显升高 （P<0.05）。

表2 各组大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 水平的比较（ng/g，±s）

表2 各组大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 水平的比较（ng/g，±s）

组别 n V E G F对照组 2 0 1 3 9.4 6±5.5 7模型组 2 0 1 7 9.7 5±7.3 7阿托伐他汀组 2 0 1 4 1.0 5±5.9 6 S D F-1 C X C R 4 2 7.8 6±6.9 8 4 7.1 3±1 5.9 5 4 5.7 7±6.4 6 1 8 7.6 6±9.4 7 2 9.4 5±6.9 8 5 3.4 4±1 0.0 4黄芪低剂量组 2 0 1 6 9.3 5±8.8 8*△◇3 9.5 8±8.9 7*△◇ 1 3 4.1 4±1 2.7 4*△◇黄芪中剂量组 2 0 3 3.6 3±1 2.7 3*△◇ 6 3.2 3±1 0.7 3*△◇ 1 4 6.3 1±1 2.7 6*△◇黄芪高剂量组 2 0 3 0.1 5±1 0.6 9△ 5 4.4 5±8.7 6△ 1 4 2.8 1±9.6 0△

2.4 各组大鼠颈动脉IMT、MT水平的比较 见图2，表3。与对照组比较，黄芪提取物各剂量组颈动脉IMT、MT 水平升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪提取物各剂量组颈动脉IMT、MT水平降低，且剂量-效应关系明显（P<0.05）；与阿托伐他汀组比较，黄芪提取物组低、中剂量组颈动脉IMT、MT水平明显升高（P<0.05）。

表3 各组大鼠颈动脉IMT、MT水平的比较（μm，±s）

组 别 n对照组 2 0模型组 2 0阿托伐他汀组 2 0 I M T M T 1 2.7 3±2.6 5 1 5 2.1 3±1 5.7 6 5 1.6 5±1 2.8 7 2 1 3.7 6±3 4.7 6 1 6.7 6±5.1 2 1 6 7.8 7±1 4.6 7黄芪低剂量组 2 0 4 1.6 3±7.6 5*△◇ 2 0 9.7 6±1 3.5 2*△◇黄芪中剂量组 2 0 2 6.7 6±8.6 5*△◇ 1 8 9.7 6±1 6.8 7*△◇黄芪高剂量组 2 0 1 7.7 6±6.4 3△ 1 7 0.7 6±1 5.8 5△

2.5 各组大鼠颈动脉CA、CVA水平的比较 见表4。与对照组比较，黄芪提取物各剂量组颈动脉CA、CVA水平升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪提取物各剂量组颈动脉CA、CVA水平降低，且剂量-效应关系明显（P<0.05）；与阿托伐他汀组比较，黄芪提取物组低、中剂量组颈动脉CA、CVA水平明显升高 （P<0.05）。

2.6 各组大鼠颈动脉MASSON染色结果 见图3。MASSON染色下胶原纤维呈蓝色，平滑肌细胞呈红色，弹力纤维呈棕色。图3可见，对照组颈动脉内膜胶原含量少，平整光滑，中膜可见少量胶原纤维（混杂于弹力纤维和肌纤维之间），排列规则；模型组颈动脉内膜明显增厚，布满大量蓝色纤维，少见红色平滑肌细胞，排列极其扭曲、断裂；黄芪提取物组低剂量组见不规则空白区域，其余视野布满大量蓝色纤维，无明显改善；黄芪提取物组中、高剂量组颈动脉内膜较模型组明显变薄，蓝色纤维减少，见弹力纤维排列整齐，局部欠规则；阿托伐他汀组MASSON染色结果同对照组。

图3 各组大鼠颈动脉（Masson染色，200倍）

3 讨 论

SDF-1/CXCR4能强烈促进血管内皮的增殖分化，是作用强烈的趋化因子，在炎症反应中与中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的趋化密切相关［7］。研究表明，在动脉粥样硬化的形成过程中，SDF-1/CXCR4的表达与白细胞介素-1（IL-1）、血小板衍生因子（PDGF）、肿瘤坏死因子 （TNF）等炎症因子的分泌以及细胞外基质（EMC）的沉淀均正相关关系明显［8-9］。动物实验研究表明［10］，在动脉粥样硬化大鼠模型中，大鼠动脉SDF-1、CXCR4蛋白表达水平异常增高。本研究中，模型组血清SDF-1、CXCR4水平明显高于对照组，这与上述结论符合。SDF-1/CXCR4是维持内皮细胞结构功能完整性必不可少的调控因子，但高水平的SDF-1/CXCR4能破坏内皮细胞结构，暴露胶原组织，刺激血小板附着和聚集，从而激活凝血反应链，导致纤维蛋白及免疫球蛋白也应激增高，同时高水平的SDF-1/CXCR4可通过增加细胞周期蛋白依赖性激酶活性，促进细胞增殖，进而使血管内壁增粗狭窄，并抑制细胞金属基质酶（MMP）的分泌，导致MMP对EMC的降解作用减弱，进而使得细胞与EMC的聚集加强，加之高水平的SDF-1/CXCR4可介导细胞的定向转移和趋化性，激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体，形成高凝状态和纤溶亢进，终致血液黏滞性及凝固性增加而处于高凝状态或血栓前状态，进一步诱发颈动脉粥样硬化的产生［11-12］。细胞试验表明，VEGF能直接促进Ⅰ型胶原和 Ⅳ型胶原、纤溶酶原激活物抑制因子、基质蛋白沉淀于系膜细胞外［13］。在高血压、动脉粥样硬化中，血管紧张素的增多也可诱导VEGF过度表达。近年来，多项研究表明［14］，动脉粥样硬化硬块斑与SDF-1、CXCR4、VEGF的异常高表达密切相关。大鼠动物试验已证实［15］，通过中西药均能明显抑制SDF-1、CXCR4、VEGF水平，缓解动脉粥样硬化症状。

黄芪提取物具有降低血黏度、改善血管舒缩功能、抗凝、抑制血栓形成、维持微循环稳定、保护血管内皮细胞的功效。本研究HE染色结果显示，黄芪提取物组中、高剂量组可见较为清晰的3层结构颈脉管壁，颈脉管内膜增厚减轻，内皮细胞结构趋于完整，可见少量巨噬细胞、泡沫细胞，平滑肌细胞排列整齐；阿托伐他汀组颈动脉病理改变基本正常；MASSON染色结果及IMT、MT、CA、CVA水平的测定与HE染色结果符合，说明黄芪提取物能明显降低大鼠颈动脉粥样硬化斑块程度，其高剂量效果尤为明显。结合对TAG、TC、LDLC、SDF-1、CXCR4、VEGF 的结果分析，与对照组比较，黄芪提取物各剂量组颈动脉TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平升高；与模型组比较，黄芪提取物各 剂 量 组 颈动脉 TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平降低，且剂量-效应关系明显；与阿托伐他汀组相比，黄芪提取物组低、中剂量组颈动脉TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平明显升高 ，高剂量组颈动脉 TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平略微升高。结果说明黄芪提取物能降低TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平，进而降低大鼠颈动脉粥样硬化斑块程度，且具有明显的剂量-效应关系。

综上所述，黄芪提取物能降低TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平，进而降低大鼠颈动脉粥样硬化斑块程度，且具有明显的剂量-效应关系。