电针对功能性消化不良大鼠MEK-ERK1/2信号通路的影响*

康朝霞 徐派的△ 唐 雷 王计雨 韩永丽 张红星

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.湖北省武汉市中西医结合医院，湖北 武汉430022）

功能性消化不良（FD）为多见的功能性胃肠疾病之一，根据罗马Ⅳ诊断标准，FD被认为是具有早饱、餐后饱胀、上腹痛或上腹烧灼感等不适，但不存在可以解释以上不适的器质性、代谢性、全身性病变［1］。根据全球流行病学的数据，FD以20.8%的高患病率，占用了大量医疗资源［2］。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞中发挥关键作用，因为它调节多种多样的细胞反应，包括调节细胞周期，影响分化、存活和凋亡［3］。并且研究发现AMPK在调节应激炎症反应发挥中重要作用，参与了胃黏膜上皮增殖、分化与凋亡等过程的调控［4］。与细胞信号调节激酶1/2（ERK1/2）相关的细胞内信号转导途径被认为是经典的丝裂原活化蛋白激酶（MEK）信号途径，被各种刺激因素激活后，可调节胃肠黏膜上皮细胞的增殖与修复，与结肠炎、胃炎等胃肠疾病密切相关。本实验采用夹尾刺激法构建FD大鼠模型，采用临床常用的电针疗法进行干预，旨在观察电针对FD模型大鼠MEK、ERK1/2蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响，以探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD 8周龄雄性大鼠40只购于湖北实验动物研究中心，体质量（200±20）g，饲养于湖北中医药大学SPF动物房，动物房温度控制在（22±2） ℃，湿度（60±10）%，明/暗每 12小时交替。每 5只单笼饲养，适应性喂养7 d后开始实验。

1.2 试药与仪器 环球牌0.3 mm×25 mm一次性无菌针灸针；韩式穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司，200A型）；兔多抗 MEK1/2抗体 （45 kD）（Affinity#AF6385；兔多抗 ERK1/2（42/44 kD）（睿瀛生物公司#RLT1625）；兔多抗磷酸化细胞外信号调节激酶 1/2（p-MEK1/2）（Ser221，44 kD）（Affinity#AF3385）；兔多抗磷酸化细胞信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）（Thr202/Tyr204，44/42 kD）（Affinity#AF1015）。

1.3 分组与造模 将40只雄性SD大鼠按随机数字表法分为空白组（10只）及造模组（30只）。对30只造模组大鼠进行造模，将其中造模成功的20只大鼠按随机数字表法分为模型组（10只）及电针组（10只）。造模方法依据参考文献采用夹尾刺激+不规则饮食的复合造模方法制备FD模型［5］。用纱布缠绕的血管钳夹大鼠尾巴末尾1/3段（尽量不使大鼠尾巴破皮），令大鼠尖叫、暴怒，引起同笼大鼠彼此厮打，每次持续30 min，每日2次（分别在上午9点，下午4点），连续造模14 d。同时进食与禁食每24小时进行交替（即隔日给予每笼220 g饲料），正常给予每日每笼400 mL水。造模大鼠呈现毛发粗糙、枯黄，进食、饮水下降，活动减弱，扎堆乃至蜷缩，情志抑郁不安，表明造模成功。电针干预方法：电针组大鼠造模成功后，进行电针干预。用自制大鼠捆绑衣将电针组大鼠束缚并悬挂于悬挂装置上。用0.3 mm×25 mm一次性不锈钢针刺大鼠双侧“足三里”穴 0.3～0.5 寸（定位参照《大鼠穴位图谱的研制》［6］），得气后接韩式电针仪（疏密波，2 Hz/100 Hz，2 mA）每次30 min，每日1次，共10 d。空白组及模型组大鼠在治疗阶段予以穿鼠衣捆绑并悬挂在悬挂装置上30 min，但不接受电针干预。

1.4 标本采集与检测 胃窦取材：电针干预10 d后，将3组大鼠禁食24 h（期间不禁水）。按照大鼠体质量（100 g为单位）予以7%水合氯醛0.5 mL进行腹腔注射麻醉，麻醉后将大鼠固定于自制鼠板上，剖腹，结扎胃贲门和幽门后剪下大鼠胃，沿胃大弯剪开胃体，洗净胃内容物后滤纸擦干，剪下胃窦放于冻存管中后立即置于液氮中快速冻存，存于-80℃冰箱中待测。用免疫蛋白印迹（Western blotting）法检测胃窦组织中MEK、ERK1/2及p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料（±s）表示。首先，进行正态性、方差齐性分析，数据符合正态分布及方差齐性者，选用单因素方差分析（ANOVA）进行多组间比较，进一步的组间两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠胃组织MEK、ERK1/2蛋白水平比较见表1，图1。与空白组比较，模型组大鼠胃组织MEK、ERK1/2蛋白表达增加（P<0.05）；与模型组比较，电针组胃组织MEK、ERK1/2表达降低（P<0.05）。结果说明电针足三里可以降低FD大鼠MEK、ERK1/2蛋白水平。

表1 各组大鼠胃窦MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比较（±s）

表1 各组大鼠胃窦MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

组别 n M E K/G A P D H E R K 1/2/G A P D H空白组 1 0 0.2 0 2±0.1 1 3 0.2 6 2±0.1 9 5模型组 1 0 0.5 6 4±0.0 9 9* 0.7 9 6±0.1 0 7*电针组 1 0 0.2 5 8±0.3 8△ 0.4 7 2±0.1 2 1△

图1 各组大鼠胃窦MEK、ERK蛋白免疫印迹图

2.2 各组大鼠胃组织p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平比较 见表2，图2。与空白组比较，模型组大鼠胃组织p-MEK、pERK1/2 蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组胃组织p-MEK、p-ERK1/2表达水平降低（P<0.05）。结果说明电针足三里可以降低FD大鼠p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平的表达。

表2 各组大鼠胃窦p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比较（±s）

表2 各组大鼠胃窦p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比较（±s）

组别 n p-M E K/G A P D H p-E R K 1/2/G A P D H空白组 1 0 0.1 3 0±0.0 4 3 0.2 1 5±0.0 9 8模型组 1 0 0.5 1 5±0.0 7 9* 0.8 2 2±0.0 8 1*电针组 1 0 0.2 4 5±0.3 8 9△ 0.4 5 9±0.1 0 9△

图2 各组大鼠胃组织p-MEK、pERK1/2蛋白免疫印记图

3 讨 论

功能性胃肠道疾病，如FD、肠易激综合征（IBS），具有相当大的社会经济负面影响［7］。虽然FD不会危及生命，但它会显著影响患者的生活质量（QOL）［8］并导致高昂的医疗费用［9］。如今，众多药物如质子泵抑制剂（PPI）、三环类抗抑郁药，抗伤害性药物和促运动剂已被用于治疗FD［10］，但由于其临床表现多样性、差异大的特点，疗效不甚满意。因此，越来越多的患者开始寻求一种经济、疗效好的替代疗法。近年来，针刺、电针等经大量的临床、实验研究证明，治疗FD疗效显著［11］，且具有经济、无明显的毒副作用的优势。本课题组在以往研究中也证实了电针足三里穴对FD具有良好的治疗作用。

FD在中医学隶属于“胃脘痛”“痞满”等范畴，其病因病机为饮食不节、情志不遂等，病变在胃，与肝脾密切相关。本实验从本病的病因出发，采用适度夹尾刺激配合隔日进食的造模方法，模拟人体肝郁气滞、脾胃失和的发病机理，使造模成功的概率大大提升。在临床运用针刺治疗FD疗效甚好，并且其治疗作用在临床及动物实验中均得到了证实。而足三里为足阳明胃经合穴，又是胃的下合穴，“合治内腑”，善调脾胃，调肠腑，滋后天生化之源。《四总穴歌》“肚腹三里留”充分说明了足三里穴善治脾胃的特点。目前，“足三里”已经成为电针治疗FD的公认效穴。电针的运用，不但传承了传统针灸的特色，并且还融会了电刺激的生理效应，卓有成效。

MAPK信号转导途径通过参与细胞生长、发育、分化和死亡过程，以及细胞间各种生化反应的识别、传递和扩增，在诱导细胞凋亡和调节应激炎症反应中起着重要作用［12-13］，参与了胃黏膜上皮增殖、分化与凋亡的调控。MAPK经典信号途径——与ERK1/2相关的信号转导途径，可被各种信号刺激（如炎症、神经损伤、神经递质）而激活，而活化的ERK1/2，即p-ERK1/2可通过激活或抑制其他蛋白激酶底物，从而调节蛋白合成，影响细胞代谢，从而参与细胞存活、增殖、分化与迁移等过程［14-15］。已有研究表明，ERK信号转导通路参与胃肠黏膜细胞的增殖与修复过程［16-18］，对于胃肠黏膜的防御与修复具有重要影响，与胃炎、胃溃疡等疾病密切相关。本实验采用免疫印迹法检测FD大鼠胃窦组织中MEK、ERK1/2蛋白表达及磷酸化程度，结果表明，与空白组相比模型组大鼠MEK、ERK1/2蛋白表达及其磷酸化程度均升高，说明在FD模型大鼠胃窦组织中，呈现MEK、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达的异常升高，而电针足三里穴抑制了FD模型大鼠胃窦MEK、ERK1/2蛋白表达及其磷酸化程度。因此MEK-ERK1/2信号通路参与电针干预FD的过程，电针可能通过抑制MEK/ERK1/2信号的激活改善FD相关症状，为电针治疗FD的机制研究提供新的研究线索，而有关MEK-ERK1/2信号转导通路在电针治疗FD大鼠过程中的具体作用机制，还有待我们进一步研究。