附子与甘草不同配伍对生物碱溶出及抗炎作用的影响*

周竹晨 裴俊弛 武宇佳 林敏秋 陈伟燕 韩 进 张宇燕

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的子根加工品，首载于《神农本草经》，列为下品，辛、甘，大有毒；归心、肾、脾经，其性刚烈迅捷，走而不守，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛的功效，用于亡阳虚脱及阳虚诸症［1］。现代研究表明，附子的生物活性成分是生物碱类物质，此外还有脂类物质以及多糖等［2-4］，具有较强的抗炎、抗肿瘤、抗衰老、强心等作用［5-8］，同时生物碱不仅是有效成分，也是附子的有毒成分［9］，具有明显的心脏毒性和神经毒性［10］。 甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflateBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的根及根茎，甘，平；归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效［1］。甘草的化学成分主要含有三萜类、黄酮类和甘草多糖类［11］，现代研究表明，甘草具有较强的免疫能力、抗肿瘤、抗炎和抗变态、提高机体、抗氧化能力等［12］。在中医临床甘草作为常见的降低毒性和调和药性之药，在与有毒中药配伍的过程中主要起“减毒”的作用［13］。传统中药配伍理论的研究和历代医家的临床经验提示，附子配伍甘草，一则温阳，调中补虚，加强附子回阳救逆作用；二则补偏救逆，有缓和之意，即现代研究所认为的减毒增效。

本实验主要通过附子甘草不同比例的配伍，检测其生物碱的溶出率［14］，研究附子甘草不同比例配伍对生物碱溶出的影响，从化学角度探讨中医附子甘草“减毒增效”的机制；同时通过醋酸致小鼠腹腔内毛细血管通透性增高，观察附子与不同比例甘草配伍后对分泌物的渗出，小鼠腹腔毛细血管通透性增高等的抑制作用，探讨附子与甘草不同比例配伍后对抗炎效应的影响。从化学角度和药效上探讨附子甘草配伍的意义，为临床用药配伍提供依据。现报告如下。

1 材 料

1.1 试药与仪器 TU-1900双束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。AG135电子天平：瑞士，梅特勒-托利多仪器有限公司。302型pH计：瑞士，梅特勒-托利多仪器有限公司。FZ102微型植物试样粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。Universal 32高速离心机：德国Hettich公司。680型酶标仪：伯乐生命医学产品有限公司。乌头碱对照品 （110720-200410）：中国药品生物制品鉴定所。附子，购自浙江临安市医药药材有限公司，经鉴定为毛茛科植物乌头碱Aconitum carmichaeliDebx.的子根的加工品，批号：20170210。甘草，购自浙江临安市医药药材有限公司，经鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的根及根茎，批号：20170125。阿司匹林肠溶片，江苏恩华药业集团有限公司，国药准字H32025931，批号：20160102。0.9%氯化钠注射液（500 mL∶4.5 g），山东齐都药业有限公司，国药准字H37020764。其余均为分析纯。

1.2 实验动物 ICR小鼠，清洁级，雄性，50只，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物中心供应，在室温为28℃的条件下饲养。实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准，合格证：SYXK（浙）2013-0184。

2 方法与结果

2.1 试液的配制 1）高氯酸铁试液的配制：70%高氯酸10 mL，缓缓加入铁粉0.8 g，微热使溶解，冷却，加无水乙醇稀释至100 mL即得。用时，取上液20 mL，加70%高氯酸6 mL，用无水乙醇稀释至500 mL。2）碱性盐酸羟胺试液的配制：氢氧化钠2.5 g，加无水乙醇成20 mL；取2.5 g盐酸羟胺，加甲醇20 mL，加热回流使溶解。用时，两液等量混合过滤即得。

2.2 乌头碱对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的乌头碱标准品10.0 mg，加无水乙醇溶解，并定容至10 mL，取1 mL溶液用乙醇稀释并定容至10 mL，作为质量浓度为100 μg/mL的乌头碱对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取附子甘草不同比例配伍（见表1）提取样品液25 mL，用氨水调节pH至9～10，用氯仿萃取 6 次（40 mL×2，30 mL×2，20 mL×2），合并萃取液，回收氯仿至干，用乙醇溶解，并定容至50 mL，作为供试品溶液。

2.4 最大吸收波长的测定 精密吸取乌头碱对照品溶液和供试品溶液各1 mL，置25 mL量瓶中，加无水乙醇使成2.5 mL，精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 mL，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 mL，摇匀，放置5 min精密加入高氯酸试液8 mL，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白溶剂，于190～700 nm波长处扫描，测得最大吸收波长，结果在515 nm处有最大吸收。

2.5 标准曲线的绘制 分别精密吸取乌头碱对照品溶液，按“2.4”项下方法，制备成 0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 μg/mL不同质量浓度的对照品溶液，并以相应试剂为空白对照，在515nm测定其吸收度。以乌头碱对照品液质量浓度（μg/mL）为横坐标，相应的吸收度（Abs）为纵坐标，进行线性回归后得到回归方程y＝0.1401x＋0.0206（R2＝0.9989，线性范围 0.8～4.8 μg/mL）。

2.6 精密度试验 取乌头碱对照品溶液，按“2.4”项下方法，并以相应试剂为空白对照，在最大吸收波长处测定其吸收度，重复测定6次，计算其精密度计算其RSD为0.85%，说明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 分别取乌头碱对照品溶液、供试液，按“2.4”项下方法，分别于制备后 0、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h测定其吸收度，以吸收度计算RSD分别为0.86%，0.28%。

2.8 重复性试验 按照供试品溶液制备方法，分别制备5份附子与甘草（1∶1）提取制备的供试品溶液，各取供试品溶液1.2 mL，按“2.4”项下方法，测定吸光度，计算乌头碱类生物碱的含量的RSD为1.00%。

2.9 回收率试验 精密吸取附子供试品溶液，加入3个不同质量浓度（样品液含量的80%、100%、120%）的对照品溶液，每个浓度重复3次，按“2.4”项下方法测定吸光度，计算其回收率，结果平均回收率为97.03%，其RSD为1.03%。

2.10 附子与不同比例甘草配伍后对生物碱溶出率的影响 附子6 g，分别与甘草不同比例配伍 （见表1），分别加水 500 mL，浸渍 30 min，煎煮 1 h，过滤，药渣加水300 mL，煎煮0.5 h，过滤，合并滤液，定容至250 mL。取定容液25 mL，用氨水调pH 9～10，氯仿萃取 6 次（40 mL×2，30 mL×2，20 mL×2），合并萃取液，回收氯仿，用甲醇溶解，并定容至10 mL。在515 nm处分别测定吸光度，根据乌头碱的线性回归方程计算生物碱含量。结果见表1，图1，附子与不同比例甘草配伍后对生物碱含量均有一定的影响，当与甘草1∶3配伍时生物碱溶出率较高，表明附子与甘草按一定的比例配伍可以明显影响生物碱含量，从而影响附子生物碱整体疗效的发挥。

表1 附子与不同比例甘草配伍后对生物碱溶出率的影响（n=3）

图1 附子与不同比例甘草配伍后对生物碱溶出的影响

2.11 附子与不同比例甘草配伍对抗炎效应的影响将小鼠随机分成11组，每组各6只，即：正常组；模型组；9个附子甘草配伍组 （分别给予各供试品溶液0.1 mL/10 g）；阿司匹林组（0.2 mg/10 g）。 各组灌服上述各药，对照组、模型组灌服等量的生理盐水。给药1 h后，尾静脉注射伊文思蓝（2%）0.1 mL/20 g，并同时腹腔注射0.6%乙酸0.2 mL/20 g，20 min后断头处死，剪开腹腔，用蒸馏水冲洗数次，收集冲洗液，调整体积至10 mL，3000 r/min，离心 10 min，取上清液。 以正常组调0，在590 nm测定吸收度OD值。各组数据以（±s）表示，采用SPSS19.0统计软件进行分析。

结果见表2、图2。模型组吸收度OD值明显升高，表明小鼠腹腔毛细血管通透性明显增加 （与正常组比较P<0.01）；与模型组比较，附子与甘草不同比例配伍后的供试品溶液具有明显的不同程度降低吸收度OD值（P<0.01），表明附子与甘草配伍能明显抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高，且不同比例配伍呈现不同程度抗炎效应。

3 分析与讨论

附子中主要含有乌头碱等生物碱类物质，是附子的主要药理活性成分，本实验采用紫外可见分光光度法建立附子中生物碱含量的方法，乌头碱属二萜生物碱，经紫外扫描，测得最大吸收波长为515 nm，绘制标准曲线，得回归方程y＝0.1401x＋0.0206（R2＝0.9989，线性范围 0.8～4.8 μg/mL），精密度、重复性、稳定性都符合要求，平均回收率为97.03%。所建立的测定方法稳定可靠，重复性好，可用于生附子以及附子加工产品的质量控制。

表2 附子与甘草不同配伍对小鼠腹腔毛细血管通透性影响（n=6，±s）

表2 附子与甘草不同配伍对小鼠腹腔毛细血管通透性影响（n=6，±s）

与模型组比较，**P＜0.01；与正常组比较，△△P＜0.01

组别 O D值正常组 0.0 0 2 2±0.0 0 0 2模型组 0.2 3 7 1±0.0 1 0 3△△配伍组1 0.2 1 0 5±0.0 1 3 7**配伍组2 0.1 7 2 6±0.0 1 7 8**配伍组3 0.1 3 2 3±0.0 1 6 5**配伍组4 0.2 0 3 7±0.0 1 2 9**配伍组5 0.2 0 1 8±0.0 1 5 6**配伍组6 0.1 9 2 8±0.0 1 6 7**配伍组7 0.2 0 0 5±0.0 1 8 2**配伍组8 0.1 8 2 7±0.0 1 3 7**配伍组9 0.2 0 8 6±0.0 1 4 7**阿司匹林组 0.0 9 1 1±0.0 1 0 4**

图2 附子与甘草不同配伍对小鼠腹腔毛细血管通透性影响

临床附子与甘草不同比例配伍组成不同的方剂，体现不同的临床疗效。本实验研究结果表明，附子与甘草按一定的比例配伍可以明显影响生物碱含量，适当的比例配伍有利于附子的主要药用成分生物碱的溶出，当附子与甘草1∶3配伍时生物碱溶出率较高，表明中药配伍通过化学成分及含量的影响体现不同的临床整体疗效。同时本实验通过醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性作用实验研究，结果表明附子与甘草配伍能明显抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高，且不同比例配伍呈现不同程度抗炎效应。

当前，对于附子甘草配伍在口服用药“减毒增效”机制的研究［15-20］，已有一定成效，有研究者推测，附子甘草配伍后，双酯型生物碱在煎煮过程中与甘草中的某些成分成盐或形成溶于水的络合物，口服后，该络合物在肠道内将游离双酯型生物碱释放，以此达到减毒目的。而且，对于附子甘草配伍煎煮“减毒增效”机制的研究也有一定成效，但其具体的物质基础和机制仍不完全清楚，甚至有相左的研究结果出现［21］。本实验从化学角度和抗炎药效学角度，探讨了附子与甘草不同比例配伍对化学成分和药效的影响，充分体现了中医用药的特色及复方配伍的合理性和科学性，对配伍后附子生物碱含量变化和药效的分析，能初步阐述配伍发挥减毒增效的物质基础，合理地探讨中医配伍发挥减毒增效的化学机制，进一步为附子甘草配伍减毒增效的作用机理研究提供了科学依据，为中药复方配伍研究提供新的思路与方法，也为临床合理配伍提供参考。