玉香参附汤对心脏骤停大鼠的心肌保护作用及对Nrf2、NQO1、HO-1表达的影响*

李 涵 姬广辉 郭立杰 吕菲菲 关 杉

（中国人民解放军海军总医院，北京 100048）

心脏骤停是指由于循环衰竭导致心率骤停，是导致心脏性猝死的主要危险因素。心脏骤停时，心脏由于丧失泵血功能导致机体处于缺血状态，引起脑、心肌等组织器官因缺血缺氧发生病理性损伤［1］。及时有效地进行心肺复苏可一定程度逆转该过程，然而临床研究表明，复苏成功率较低，患者远期预后效果差［2］。研究证实，氧化应激损伤、活性氧过度产生等可能参与缺血/再灌注所致心肌损伤的发生过程，心脏缺血缺氧可进一步抑制心肌功能，导致活性氧、脂质过氧化物等过度累积，加重损伤［3-4］。传统中药方剂玉香参附汤对心力衰竭患者有明显的改善作用，包含其主要成分红参和附片的参附益心颗粒可有效保护急性心梗大鼠心肌损伤，阻滞慢性心衰的发生［5］，但玉香参附汤对心脏骤停/心肺复苏后大鼠心肌功能的作用尚不清楚。本研究通过构建心脏骤停/心肺复苏大鼠模型，观察玉香参附汤对心脏骤停/心肺复苏大鼠心肌损伤的影响并初步探讨其机制，旨在探究其保护心脏骤停/心肺复苏大鼠心肌损伤的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠90只，体质量（180～200）g，SPF级别，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）-2015-0002。所有研究用大鼠集中常规饲养于本院实验动物中心，给予所有大鼠自由饮水、饮食，进行适应性饲养1周。所有实验均遵循《实验动物管理条例》。

1.2 试药与仪器 玉香参附汤（玉竹20 g，香加皮5 g，预煎红参10 g，预煎制附子10 g，女贞子10 g，丹参15 g，桑寄生10 g，白前10 g），药材购于北京同仁堂药店，每剂加入500 mL煎煮至150 mL，再次加水煎煮至150 mL，将两次煎剂合并，熬制成膏状（生药含量2 g/mL），置于4℃冷藏备用。使用时采用0.9%氯化钠注射液稀释，灌胃给药剂量按体表面积进行换算得出。依拉达奉注射液（规格：20 mL，30 mg。 批号 20150133），购自昆明积大制药公司；苏木素-伊红HE染色试剂盒（货号 E607318）、蛋白定量试剂盒（货号 C600641），购自上海生工生物技术公司；丙二醛（MDA）试剂盒（货号 S0131）、谷胱甘肽（GSH）试剂盒（货号 S0073）、活性氧（ROS）试剂盒（货号 S0033）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（货号 S0082）、超氧化歧化酶（SOD）试剂盒（货号S0087），购自碧云天公司；DAB显色试剂盒，购自中杉金桥公司；兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3，羊抗兔二抗，购自美国CST公司；石蜡切片机，德国Leica公司；普通光学显微镜、荧光显微镜，购自日本Olympus公司；蛋白电泳仪、半干转膜仪，美国Bio-Rad公司等。

1.3 分组与造模 按照随机数字表法将90只大鼠随机分为对照组、模型组，玉香参附汤低、中、高剂量组，依拉达奉组，每组15只。对除对照组外大鼠，按照文献［6］采用交流电经食管刺激诱导心室颤动法复制心脏骤停模型，心脏骤停5 min后，开始心肺复苏，1 min时给予各大鼠静脉注射肾上腺素（0.02 mg/kg），若无效则于4 min时重复心肺复苏，5 min内未成功复苏大鼠为造模失败，从备用大鼠中根据随机原则补足各组例数。对照大鼠仅给予气管插管，不诱导心脏骤停。术后正常给予常规饲养，记录各组大鼠生存情况，持续观察72 h。玉香参附汤低、中、高剂量组大鼠于术后当日起，每日分别予玉香参附汤［5 mg/（kg·d）］、［10 mg/（kg·d）］、［20 mg/（kg·d）］灌胃治疗，灌胃容积为 10 mL/500 g；依拉达奉组大鼠于术后当天起，每日给予依拉达奉［5 mg/（kg·d）］灌胃治疗，灌胃容积为 10 mL/500 g；对照组及模型组于术后当天起，每日给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃，持续72 h后，给予各大鼠处分麻醉处死，立即取出大鼠心脏，洗净后对称切半，一半切成1 cm大小3小块后分成2份，一份用于ROS水平检测，一份置于4%多聚甲醛中固定，制备石蜡切片；一半切碎后分为2份，一份制备组织匀浆液，一份采用液氮速冻，转至-80℃保存。

1.4 标本采集与检测 1）HE法观察心肌组织结构：大鼠心肌组织切片进行脱蜡、水化操作。采用苏木素-伊红（HE）试剂盒对切片染色，完成后以中性胶封闭玻片，采用光学显微镜观察并拍照。2）心肌组织ROS水平测定：采用ROS试剂盒检测大鼠心肌组织中ROS水平，以DCFH-DA标记活性氧，阳性细胞呈红色荧光，以DAPI试剂标记细胞核，阳性细胞呈蓝色荧光，以红色荧光细胞占蓝色荧光细胞的比例评估心肌细胞中ROS水平。3）心肌组织MDA含量、CAT活性及SOD活性、GSH含量的测定：将大鼠心肌组织匀浆液取出，严格按照MDA检测试剂盒、GSH检测试剂盒、CAT检测试剂盒、SOD检测试剂盒操作说明书检测各组大鼠心肌组织中MDA含量、GSH含量及CAT活性、SOD活性。 4）蛋白印记（WB）法检测 Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表达：将大鼠心肌冷冻组织充分研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，采用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取各组大鼠心肌组织中细胞质及细胞核总蛋白，采用蛋白定量试剂盒测定蛋白总量后，煮样，进行SDS-凝胶电泳。电泳后采用半干法转印至PVDF膜上；5%脱脂奶粉常温封闭1 h；分别加入兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3（1∶500），4℃孵育 6h；加入羊抗兔二抗（1∶3 000），室温孵育30 min。采用化学发光试剂盒处理后进行检测，Tanon软件拍摄目的条带图像并进行分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件。计量数据均以（±s）表示，多重比较行单因素方差分析，两两比较行t检验；计数资料采用“率”表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠生存情况比较 见表1。与对照组比较，模型组大鼠总存活时间显著缩短、30 d存活率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，玉香参附汤低、中、高剂量组及依拉达奉组大鼠总存活时间显著延长（P＜0.05）、30 d存活率明显升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠生存情况比较

2.2 各组大鼠心肌组织结构比较 见图1。对照组大鼠心肌组织结构规则、心肌细胞紧致排列、心肌纤维完整、排列规则。心脏骤停大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂、排列紊乱，出现大量破碎、坏死和炎性细胞，呈现出病理损伤。玉香参附汤低、中、高剂量组及依拉达奉组大鼠心肌组织中病变细胞减少，心肌纤维趋于完整，损伤情况均有改善。

图1 HE染色观察玉香参附汤对心肌组织结构的影响（HE 染色，20倍）

2.3 各组大鼠心肌组织ROS水平的比较 见图2。与对照组比较，心脏骤停大鼠心肌组织中ROS阳性细胞比例显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量玉香参附汤组大鼠心肌组织中ROS阳性细胞比例显著减少（P＜0.05）。

图2 各组大鼠心肌组织中ROS表达（DHE荧光，200倍）

2.4 各组大鼠心肌组织氧化应激水平的比较 见表2。与对照组比较，其他各组心脏骤停大鼠心肌组织中MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活减弱（P＜0.05）；与模型组比较，玉香参附汤低、中、高剂量组及依拉达奉组大鼠心肌组织MDA含量降低、GSH含量上升、CAT和SOD酶活增强（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠心肌组织中Nrf2、NQO1、HO-1表达的比较 见图3，表3。与对照组比较，心脏骤停大鼠心肌组织NQO1、HO-1蛋白表达量明显降低，细胞质Nrf-2蛋白表达量显著增高，细胞核Nrf-2蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，玉香参附汤低、中、高剂量组及依拉达奉组大鼠心肌组织NQO1、HO-1蛋白表达量明显增高（P＜0.05），细胞质Nrf-2蛋白表达量明显降低（P＜0.05），细胞核Nrf-2蛋白表达量明显增高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠心肌组织中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比较（±s）

组 别 n对照组 1 5模型组 1 5依拉达奉组 1 5 M D A（m m o l/g） G S H（m m o l/g） C A T（U/m g） S O D（U/m g）2.6 5±0.4 4 1 5.4 6±3.0 5 2 6 9.1 7±2 1.1 5 1 6 9.4 3±2 4.3 5 6.9 7±1.2 9* 5.6 3±1.1 7* 1 7 8.7 5±1 8.3 2* 7 9.5 4±1 4.7 3*3.5 4±0.6 9*△ 1 1.4 9±2.1 2*△ 2 3 1.3 8±2 3.4 7*△ 1 2 3.3 6±2 2.3 8*△玉香参附汤低剂量组 1 5 5.2 7±1.0 3*△ 7.2 4±1.3 5*△ 1 8 9.2 3±2 2.5 6*△ 1 5 7.7 4±2 3.5 9*△玉香参附汤中剂量组 1 5 4.0 4±0.8 1*△※ 9.9 5±1.8 9*△※ 2 1 6.7 6±2 1.4 5*△※ 1 4 0.9 2±2 3.1 1*△※玉香参附汤高剂量组 1 5 3.1 2±0.6 2*△※◇ 1 2.4 8±2.5 3*△※◇ 2 4 5.2 7±2 3.3 5*△※◇ 1 2 1.4 5±2 3.3 2*△※◇

图3 各组大鼠心肌组织Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达

表3 各组大鼠心肌组织中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达量比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达量比较（±s）

组 别 n对照组 1 5模型组 1 5依拉达奉组 1 5 N Q O 1/G A P D H H O-1/G A P D H质N r f/G A P D H 核N r f/H 3 1.0 8±0.1 9 1.1 7±0.0 9 0.5 1±0.1 1 1.5 4±0.2 5 0.4 9±0.0 9* 0.1 9±0.0 3* 1.4 7±0.3 1* 0.6 7±0.1 2*1.1 1±0.2 1*△ 1.2 3±0.1 3*△ 0.3 9±0.0 6*△ 1.2 3±0.2 4*△玉香参附汤低剂量组 1 5 0.6 5±0.1 1*△ 0.7 6±0.1 3*△ 0.6 9±0.1 3*△ 1.0 4±0.1 3*△玉香参附汤中剂量组 1 5 0.8 7±0.1 4*△※ 1.2 7±0.1 9*△※ 0.4 8±0.0 7*△※ 1.2 1±0.1 4*△※玉香参附汤高剂量组 1 5 1.1 6±0.2 2*△※◇ 1.3 5±0.2 1*△※◇ 0.2 0±0.0 5*△※◇ 1.6 1±0.3 6*△※◇

3 讨 论

心脏骤停是临床上一种非常危险的急症，具有高致死率、高致残率的特点。心肺复苏是临床上针对心脏骤停的主要抢救措施。随着医疗条件的提高和医疗技术的进步，心肺复苏技术有了很快进步，但复苏成功率仍然很低，且后期易出现不同程度器官障碍等并发症。其中心脏骤停时导致组织器官处于缺血缺氧状态的时间长短和心肺复苏恢复机体自主循环时对组织器官造成的缺血/再灌注损伤程度密切相关［7］。心脏是人体的供血器官，心肌组织作为其重要组成部分，对缺血和缺血再灌注损伤十分敏感。本研究采用交流电经食管刺激诱导心室颤动法复制心脏骤停模型［6］。结果显示，模型组大鼠心肌细胞、心肌纤维排列紊乱，心肌纤维断裂，出现大量破碎、坏死和炎性细胞，呈现出病理损伤，表明心脏骤停模型大鼠心肺复苏后心肌表现出一定损伤症状。进一步观察发现，模型组大鼠平均生存时间和30 d生存率均显著低于对照组，提示心脏骤停/心肺复苏大鼠复苏存活率较低。

中药玉竹、香加皮、红参、制附子、丹参、白前等是玉香参附汤的主要药效成分，具有活血通经、散瘀通脉的功效［8］。玉香参附汤是在参附注射液的基础上加以中药玉竹、香加皮等配制而成。研究表明，参附注射液可有效改善心力衰竭患者心脏功能，增强常规西药的治疗效果［9］。顾伟等研究提示，参附注射液可通过调控调节性T细胞转录因子表达的平衡改善心脏骤停/心肺复苏猪的心室收缩功能，减轻氧化应激反应，缩短心肺复苏时长，减轻心肌组织损伤，提示参附注射液具有一定的心肌保护作用［10］。本研究采用玉香参附汤作用心脏骤停/心肺复苏大鼠，结果发现，玉香参附汤治疗可显著改善大鼠心肌组织损伤程度，提示玉香参附汤具有改善心脏骤停大鼠心肌损伤的作用，但其作用机制尚不明确。

心肌组织中氧自由基等活性氧水平的升高是缺血/再灌注引起心肌损伤的主要原因之一，在心脏骤停损伤过程中发挥着重要作用［11］。正常情况下，机体内环境中有少量ROS存在，参与正常生理代谢过程［12］。然而，当心脏骤停发生时，心脏失去基本泵血功能，机体处于缺血缺氧的环境，机体可产生并积累大量氧自由基，同时，心肌损伤状态下，心肌组织清除氧自由基的能力减弱，进一步导致氧自由基等累积，过量活性氧可能与脂质、蛋白质等发生反应，产生MDA等脂质过氧化物，诱导细胞凋亡、死亡，进而导致组织器官功能障碍［13］。Abraham等发现，抑制心肌细胞特异性肌钙蛋白-相互作用激酶可以通过抑制氧化应激抑制缺血性心脏病引起的心肌损伤和心室不良重构［14］。Wang等发现，黄芩可通过抑制氧化应激反应抑制心肌细胞缺血/再灌注所致细胞凋亡，保护机体损伤［15］。本研究发现，与对照组比较，心脏骤停大鼠心肌组织ROS阳性细胞比例增加、MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活减弱；玉香参附汤治疗后，与模型组比较，低、中、高剂量玉香参附汤组大鼠心肌组织中ROS阳性细胞比例减少、MDA含量降低、GSH含量升高、CAT和SOD酶活增强，表明玉香参附汤治疗可增强心脏骤停大鼠对活性氧的清除能力，降低机体中ROS和脂质过氧化物含量，提示玉香参附汤可能通过减轻氧化损伤程度保护心脏骤停/心肺复苏所致大鼠心肌损伤。

研究表明，氧化应激导致的细胞损伤与核转录因子（Nrf2）/血红素氧合酶 1（HO-1）信号通路密切相关［16］。研究发现，正常状态下，细胞质中Nrf2蛋白以与Keap1蛋白结合的无活性形式存在，受到活性氧等刺激时，Nrf2发生磷酸化后与Keap1脱离，转移至细胞核，活化后的Nrf2与抗氧化反应元件结合，启动NADH脱氢酶1（NQO1）、HO-1等抗氧化酶的基因表达，提高机体抗氧化损伤的能力［17-18］。Liu等发现，萝卜硫素可通过抑制Nrf2等蛋白表达，抑制活性氧所致晶状体上皮细胞凋亡和坏死［19］。Zhang等发现，黄连素可能通过抑制Nrf2通路激活，减轻活性氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡，保护肾组织损伤［20］。本研究发现，心脏骤停/心肺复苏后，大鼠心肌组织NQO1、HO-1蛋白表达量降低，Nrf-2蛋白细胞核转移量减少；玉香参附汤治疗后，与模型组比较，低、中、高剂量玉香参附汤组大鼠心肌组织NQO1、HO-1蛋白表达量升高，Nrf-2蛋白细胞核转移量增多，表明玉香参附汤可能通过促进Nrf-2蛋白细胞核转移进而促进其下游NQO1、HO-1等蛋白表达保护心脏骤停/心肺复苏所致大鼠心肌损伤。

综上所述，玉香参附汤可能通过促进Nrf-2、NQO1、HO-1蛋白表达，减轻心肌组织氧化应激，实现对心脏骤停/心肺复苏所致心肌损伤的保护作用。