利拉鲁肽对2型糖尿病非酒精性脂肪肝病小鼠的作用研究

邢冬杰 宿世震 陈桂玉 张彩坤 宋桂红 刘晓庆

[摘要]目的 探討利拉鲁肽对2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的保护作用及机制。方法 选取50只小鼠，随机分为正常对照组（15只）和高糖高脂饲料组（35只），采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素的方法，建立2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的小鼠模型，经处理分为正常对照组、模型对照组、利拉鲁肽组，每组10只。利拉鲁肽皮下注射8周，观察各组空腹血糖（FBG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）及肝指数等指标；检测肝组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）的水平；采用HE染色及油红“O”染色观察肝组织病理改变；采用免疫组织化学法检测肝组织中B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（BaX）的表达。结果 与正常对照组比较，模型对照组大鼠的FBG、FINS、HOMA-IR增高，血清TG、TC、ALT、AST含量升高，肝指数增高，肝组织中SOD活性降低、MDA含量升高、TNF-α及IL-8水平上升，HE染色、油红“O”染色肝组织中脂肪性变明显，Bcl-2蛋白表达明显减少，BaX蛋白表达明显增加（P<0.01，P<0.05）。与模型对照组比较，利拉鲁肽组的FBG、TG、TC、ALT、AST含量降低，HOMA-IR及肝指数下降；肝组织中SOD活性升高，MDA含量及TNF-α、IL-8水平下降（P<0.01）；HE染色、油红“O”染色肝组织中脂肪性变明显减轻，Bcl-2蛋白表达明显增加，BaX蛋白表达明显降低（P<0.01）。结论 利拉鲁肽对2型糖尿病非酒精性脂肪肝病的小鼠肝脏具有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用、减少炎症因子的表达及调节凋亡相关蛋白Bcl-2、BaX的表达有关。

[关键词]2型糖尿病；非酒精性脂肪肝病；利拉鲁肽；B淋巴细胞瘤-2；Bcl-2相关X蛋白

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）11（c）-0012-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect and mechanism of Liraglutide on non-alcoholic fatty liver disease in mice with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 50 mice were selected and randomly divided into normal control group （n=15） and high-suger and high-fat diet group （n=35）. A non-alcoholic fatty liver disease model of type 2 diabetes mellitus by high-sugar and high-fat diet combined with low-dose streptozotocin was established. The mice were divided into the normal control group， the model control group， and the liraglutide group after treatment， with 10 cases in each group. Liraglutide was injected subcutaneously for 8 weeks. Fast blood glucose （FBG）， alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）， insulin （FINS）， insulin resistance index （HOMA-IR） and liver index were observed in each group. The level of SOD， MDA， TNF-α， IL-8 in liver tissue were detected. HE staining and oil red “O” staining were used to observe the pathological changes of liver tissue. Immunohistochemistry was used to detect the expression of B-lymphoma-2 （Bcl-2） and Bcl-2 related X-protein （BaX） in liver tissue. Results Compared with the normal control group，the level of FBG， FINS and HOMA-IR in model control group increased， the level of serum TG， TC， ALT， AST content increased， the level of liver index increased， SOD activity decreased， MDA content increased， TNF-α and IL-8 levels increased， HE staining and oil red “O” staining in liver tissue fatty change was obvious， Bcl-2 protein expression significantly decreased， and BaX protein expression increased significantly （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model control group， the contents of FBG， TG， TC， ALT， AST， HOMA-IR and liver index decreased， SOD activity increased， MDA content， TNF-α and IL-8 decreased in the Liraglutide group （P<0.01）. HE staining and oil red “O” staining significantly reduced fatty degeneration， the expression of Bcl-2 protein significantly increased and the expression of BaX protein significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Liraglutide has protective effects on the liver of non-alcoholic fatty liver disease in mice with type 2 diabetes. The mechanism may be related to anti-oxidation， reducing the expression of inflammatory factors and regulating the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and BaX.

[Key words] Type 2 diabetes； Non-alcoholic fatty liver disease； Liraglutide； B-cell lymphoma-2； Bcl-2 associated X protein

近年来，糖尿病非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率日益升高，据统计，2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）的NAFLD发病率达34%～74%，特别是伴有肥胖的T2DM，NAFLD发病率几乎为100%[1-2]，因此，明确T2DM合并NAFLD的发病机制以及寻求有效的药物，对防治T2DM合并NAFLD具有重要意义。利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1受体激动剂类药物，具有降低血糖、血脂、减轻体重、改善胰岛素抵抗等作用[3-4]，其作为新的降糖药物已广泛应用于T2DM的临床治疗。新近研究显示[5]，利拉鲁肽对肝脏具有保护作用，可以降低NAFLD大鼠的三酰甘油（triglyceride，TG）、胆固醇（cholesterol，TC）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）的水平。为了深入研究利拉鲁肽独立于降糖之外的作用，本研究通过高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素建立T2DM合并NAFLD小鼠模型，给予利拉鲁肽干预治疗8周，观察利拉鲁肽对肝脏的保护作用和及其机制，为其临床治疗提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 KM小鼠，6周龄，SPF级，雄性，体质量18～23 g，山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20130009。

1.1.2药物与试剂 利拉鲁肽为丹麦诺和诺德公司生产，批号为S20160020；高糖高脂饲料（10%猪油、10%蔗糖、2%胆固醇、10%蛋黄粉、68%基础饲料）同江苏协同生物有限公司提供，批号为201609012；链脲佐菌素（streptozocin，STZ），由Sigma公司国内分装，批号为S0132；TG、TC、ALT、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、考马斯亮藍蛋白、丙二醛（malondialdehyde，MDA）购自南京建成生物科技有限公司，批号分别为20170218、20170311、20170215、20170321、20170221、20170308、20170319；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-8（interleukin -8，IL-8）、游离胰岛素（free insulin，FINS）购自南京晓劢生物科技有限公司，批号为20170308、20170322、20170328；B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体及Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 -assaciated xprotein，Bax）抗体由Santa cruz提供，批号为20170326；根过氧化物酶购自碧云天生物技术有限公司，批号为122115160419。

1.1.3仪器 微量血糖仪及配套试纸（德国罗氏诊断公司，活力型）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司，L-530）；全自动生化分析仪（雅培，CTi16000）；冰冻切片机（德国leica，CM1860）；光学显微镜（日本奥林巴斯有限公司，TS-100）；智能放免r测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂，SN-695B型）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，5300型）等。

1.2方法

1.2.1模型制备 50只小鼠，室温22～25℃，自由进食饮水，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（15只）与高糖高脂饲料组35只。正常对照组普通饲料喂养至实验结束，高糖高脂饲料组喂养8周后，STZ溶液200 mg/kg腹腔注射，正常对照组注射枸橼酸钠缓冲液。72 h后测定高糖高脂饲料组的FBG，初测FBG≥16.5 mmol/L并稳定5 d，复测16.7 mmol/L≤FBG≤25.0 mmol/L为T2DM成模小鼠，共入选25只，余剔除。从正常对照组与T2DM成模小鼠中各随机选取2只处死，取血测定TC、TG、ALT、AST，取肝组织HE染色，证实NAFLD模型复制成功[6-7]。

1.2.2分组及给药方法 从NAFLD模型小鼠随机选取20只分为模型对照组和利拉鲁肽组（100 μg/kg），每组10只。利拉鲁肽组给予利拉鲁肽皮下注射，每日1次，持续8周；正常对照组（随机选取10只）与模型对照组小鼠给予相应体积的生理盐水。皮下注射时间均为每日下午16：00，每周定期测量各组小鼠体质量，并根据体质量调整给药剂量。

1.2.3指标检测 ①血清指标检测：末次给药后所有小鼠禁食不禁水空腹过夜，测量体质量后予以戊巴比妥钠腹腔麻醉后剪尾取血，采用微量血糖仪检测FBG；心脏取血，离心（3000 r/min）15 min取血清，全自动生化分析仪检测TG、TC、ALT、AST，采用放免法测定FINS，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR=FBG×FINS/22.5）。②肝指数：取血后迅速剖腹取肝脏，生理盐水冲洗、滤纸吸干后测定肝湿重，肝湿重/体质重×l00%=肝指数。③肝组织SOD、MDA、TNF-α、IL-8检测：取肝脏右叶肝组织0.5 g剪碎，冰浴下研磨制备组织匀浆，离心后吸取上清液待测。④肝组织HE染色、油红“O”染色：于肝左叶内侧取小块肝组织，置于蔗糖中待做冰冻切片及油红“O”染色，再取小块肝组织至于10%中性甲醛固定液中固定，石蜡包埋制备切片及HE染色，观察肝组织病变情况。⑤免疫组化法检测凋亡蛋白Bcl-2/BaX的表达情况：石蜡切片脱蜡后，纯化水冲洗，PBS浸泡5 min，EDTA抗原修复；H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗，4℃一抗过夜，PBS冲洗，二抗，DAB显色剂显色，镜下观察测量，细胞浆有棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异染色者为阳性细胞，取平均光密度值（IOD）表示相对表达量。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK法，不符合正态分布首先对原始数据进行自然对数转换后进行统计，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比较

与正常对照组比较，模型对照组小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR显著升高（P<0.01）；与模型对照组比较，利拉鲁肽组的FBG、FINS、HOMA-IR明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2各组小鼠TG、TC、ALT、AST、肝指数的比较

与正常对照组比较，模型对照组小鼠的TG、TC、ALT、AST、肝指数升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型对照组比较，利拉鲁肽组的TG、TC、ALT、AST、肝指数明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。

2.3各组小鼠肝组织SOD、MDA、TNF-α、IL-8的比较

与正常对照组比较，模型对照组大鼠的SOD活性降低，MDA含量、TNF-α及IL-8水平升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型对照组比较，利拉鲁肽组的SOD活性明显升高，MDA含量、TNF-α及IL-8水平下降，差异有统计学意义（P<0.01）（表3）。

2.4各组小鼠肝组织HE染色结果的比较

与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝组织内出现大量大小不等的脂肪空泡，细胞核被挤向周边，部分可见散在坏死灶及炎性细胞浸润。与模型对照组比较，利拉鲁肽组小鼠肝脏组织病变减轻，胞浆脂滴明显减小，肝细胞排列整齐，脂肪变性程度轻（图1）。

2.5各组小鼠肝组织油红“O”染色结果的比较

与正常对照组比较，模型对照组脂滴多且广泛分布在肝脏组织胞浆中；与模型对照组比较，利拉鲁肽组脂滴明显减少（图2）。

2.6各组小鼠肝组织Bcl-2及BaX表达的比较

三组小鼠肝脏中均有Bcl-2、BaX的表达，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝脏中的Bcl-2表达弱，平均光密度值降低，BaX表达增强，平均光密度值升高，Bcl-2/BaX的比值下降，差異有统计学意义（P<0.01）；与模型对照组相比，利拉鲁肽组肝脏中的Bcl-2表达增强，平均光密度值降低，BaX表达明显降低，平均光密度值降低，Bcl-2/BaX的比值升高，差异有统计学意义（P<0.01）（图3、表4）。

3讨论

目前认为，糖尿病合并NAFLD的发病机制是“二次打击学说”，胰岛素抵抗（IR）是NAFLD发病的初次打击，引起肝细胞脂肪堆积，肝的结构和功能受损[8]；氧化应激与脂质过氧化作用是第二次打击，诱导肝细胞凋亡[9]。IR是T2DM和NAFLD的共同病理生理基础，改善IR，改善糖脂代谢紊乱、脂质过氧化是T2DM合并NAFLD防治领域研究的热点[10-11]。在本实验中，模型对照组小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST、肝指数明显升高，肝脏脂肪变性程度显著增高，差异有显著性，提示模型成立，与国内外相关研究结果相符[12-13]。利拉鲁肽组小鼠的FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、ALT、AST、肝指数均呈现下降，病理结果显示脂肪性变减轻，提示利拉鲁肽对T2DM合并NAFLD小鼠具有降脂保肝作用。

糖尿病发病过程中，在体内高糖的状态下，活性氧簇及活性氮簇生成过多，超过机体清除能力而导致氧化应激[14-15]。SOD可反映机体或细胞抗氧化的能力，MDA可间接反映机体受氧自由基攻击的程度，因此通过测定体内SOD、MDA水平，能够反映机体组织的氧化-抗氧化状态[16]。氧化反应启动，导致线粒体DNA破坏、炎症细胞因子释放，TNF-α、IL-8可加速TG在肝细胞的合成并促进脂肪酸聚集，使脂肪酸的氧化受到抑制，导致蛋白酶加速分泌和炎细胞浸润及大量氧化产物产生，对肝脏造成二次打击，促进NAFLD进一步加重[17-18]。本实验中，模型对照组小鼠肝组织中的SOD活性下降，MDA、TNF-α、IL-8水平升高，利拉鲁肽组小鼠肝组织中的SOD活性升高，MDA、TNF-α、IL-8水平下降，提示利拉鲁肽能减轻小鼠体内的脂质过氧化水平，提高其抗氧化能力，并降低其炎症水平。

Bcl-2和BaX是细胞凋亡中极其重要的2个调控基因，前者抑制凋亡，后者促发凋亡，而Bcl-2/Bax比值决定着凋亡信号刺激后细胞的存活状态[19-20]。本实验中，与模型对照组比较，利拉鲁肽能显著增加小鼠肝细胞的Bcl-2蛋白表达、减少肝细胞Bax蛋白表达，提示利拉鲁肽可上调抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达，下调促凋亡蛋白Bax蛋白，提高Bcl-2/Bax比值，对肝细胞凋亡有抑制作用。

综上所述，利拉鲁肽对T2DM合并NAFLD的小鼠肝脏具有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用、减少炎症因子的表达及调节凋亡相关蛋白Bcl-2，BaX的表达有关，有可能成为T2DM合并NAFLD新的治疗药物。

[参考文献]

[1]Rafiq N，Younossi ZM.Effects of weight loss on nonaicoholic fatty liver disease[J].Semin Liver Dis，2008，28（4）：427-433.

[2]Willamson RM，Price JF，Glancy S，et al.Prevalence of and risk factors for hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver disease in people with type 2 diabetes：the Edinburgh type 2 diabetes study[J].Diabetes Care，2011，34（5）：1139-1144.

[3]Ahren B，Schmitz O.GLP-1 receptor agonists and DPP-4 inhibitors in the treatment of type 2 diabetes[J].Horm Metab Res，2004，36（11-12）：867-876.

[4]曾志刚，徐丽姝，关丽嫦，等.利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠脂联素及胰岛素抵抗的影响[J].中国病理生理杂志，2014，30（3）：533-537.

[5]陈左平.利拉鲁肽治疗2型糖尿病合并轻中度慢性肾脏病的有效性和安全性分析[J].中国当代医药，2016，23（30）：70-72.

[6]梁志清，白纪红，赵日红，等.银杏黄酮对非酒精性脂肪肝模型小鼠的作用及NF-κB在其机制中的相关性分析[J].天然产物研究与开发，2016，28（2）：277-282.

[7]常珊珊，徐济良.非酒精性脂肪肝发病相关因子的机制研究新进展[J].南通大学学报（医学版），2013：33（1）：56-60.

[8]池肇春.非酒精性脂肪性肝病发病机制研究进展与现状[J].世界华人消化杂志，2017，25（8）：670-683.

[9]穆杰，王庆国，王雪茜，等.非酒精性脂肪肝机制及其与慢性应激相关性的研究进展[J].世界华人消化杂志，2016， 24（5）：692-698.

[10]Tan TC，Crawford DH，Jaskowski LA，et al.Altered lipid metabolism in Hfe-knockout mice promotes severe NAFLD and early fibrosis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2011，301（5）：G865-G876.

[11]张秀梅，胡长军，崔兆辉.2型糖尿病并发非酒精性脂肪性肝病发病机制的研究进展[J].现代生物医学进展，2013， 13（7）：1389-1391.

[12]Ryu JE，Jo W，Choi HJ，et al.Evaluation of nonalcoholic fatty liver disease in C57BL/6J mice by using MRI and histopathologic analyses[J].Comp Med，2015，65（5）：409-415.

[13]赵雅培，赵东强，张松筠，等.阿卡波糖、二甲双胍及吡格列酮对糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织肿瘤坏死因子α及细胞色素P4502E1的影响[J].中国糖尿病杂志，2014，22（8）：745-749.

[14]Giacco F，Brownlee M.Oxidative stress and diabetic compl ications[J].Circ Res，2010，107（9）：1058-1070.

[15]赵国莉，吕肖锋，程千鹏.氧化应激与2型糖尿病相关性的观察[J].中国糖尿病杂志，2013，21（6）：514-517.

[16]郝惠惠，邵珠民，杜倩，等.槲皮素对糖尿病大鼠氧化应激及TGF-β1/CTGF的影响[J].中国醫院药学杂志，2012， 32（13）：1012-1016.

[17]王军英，王红梅，王军，等.非酒精性脂肪肝患者血清TNF-α、IL-8水平及意义[J].中国现代医学杂志，2013， 23（33）：42-46.

[18]谢伶俐，吴方建，梁斌，等.吡格列酮对合并代谢综合征的非酒精性脂肪性肝病患者血清TNF-α、IL-6的影响及意义[J].中国医院药学杂志，2016，36（12）：1007-1011.

[19]Li G，Ren J，Xu F，et al.Non-structural and nucleocapsid proteins of Punta Toro virus induce apoptosis of hepatocytes through both intrinsic and extrinsic pathways[J].Microbiol Immunol，2010，54（1）：20-30.

[20]郝欣欣，马博清，王敬，等.罗格列酮对高脂饮食大鼠胰腺核因子-κB表达和β细胞凋亡的影响[J].2013，33（8）：3921-3923.