东海中华管鞭虾多酚氧化酶（PPO）的纯化及特性研究

吕敏，黄光华，杨慧赞，王瑞，马华威，甘晖，曾兰，相兴伟

（1.广西壮族自治区水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021）（2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316000）（3.广西水产畜牧学校，水产养殖研究室，广西南宁 530021）

关键字：中华管鞭虾；多酚氧化酶(PPO)；酶学性质；纯化

虾类在储藏和运输过程中，其体内多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)诱导的黑变大大降低了虾的品质和市场价值，造成巨大损失[1]。因此，我们需要获取的高纯度的PPO，并对其特性进行研究，为了有效地控制中华管鞭虾在运输和储藏过程的黑变提供参考。黑变发生主要是PPO诱导酚类化合物生成醌，醌非酶聚合促进高分子不溶性黑色素沉淀，造成虾黑变[2]。研究发现，由于虾体内的酚类化合物含量高以及纯化过程中这些酚类物质易于与 PPO形成不可逆结合，给从虾类获得高纯均一的PPO带来了困难[3]。目前，国内外研究了挪威龙虾(Nephrops norvegicus)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)、佛罗里达龙虾(Panulirus argus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的PPO纯化技术和酶特性[4,5]，比如Zotos和Taylorp等研究了挪威龙虾 PPO的部分提纯工艺和在黑变激活机制中的作用[6]；Encarnacion等[7]发现蘑菇提取活性物对日本对虾黑变具有抑制作用；Manheem等[8]报道称，不同冷藏条件下凡纳滨对虾PPO变化不同，温度与PPO活性呈反比，温度越低其活性较弱；Ali等[9]报道了佛罗里达龙虾黑变的PPO提纯和激活机制，Nirmal等[10]研究了凡纳滨对虾 PPO纯化手段和生物学特性。

国内初步研究了中华管鞭虾(Solenocera crassicornis) PPO的提纯手段和部分生物特性，主要匀浆浸、硫酸铵无分级沉淀提纯，并调查了该PPO在各组织分布、选取部分底物研究酶特性，以及筛选抑制剂[11～15]，国外未见相关报道。未高度纯化的中华管鞭虾PPO，限制了对其酶特性的深入研究，因而，我们需要选择合适的纯化技术和步骤对中华管鞭虾PPO进行高度纯化，再对其酶特性进行研究。本文主要采用硫酸铵分级沉淀、DEAE离子、苯基琼脂糖凝胶过滤纯化从中华管鞭虾体内提取的PPO，对其动力学特征进行探讨，并选取不同抑制剂和金属离子为底物研究该PPO特性，为寻找廉价、安全、有效、新型的中华管鞭虾黑变抑制物质提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品

中华管鞭虾于2015年10月捕捞于浙江舟山市普陀区沈家门港近岸东海海域(东经 121.39°，北纬29.51°)，平均体长9.0±0.9 cm和体重18.5±3.5 g，冰块冷冻送至实验室后去除头胸部，冷水冲洗后液氮冷冻，搅切器粉碎成粉末，真空包装-60 ℃保存备用。

1.2 试剂

Tris-HCl缓冲液、丙酮、乙二胺四乙酸(EDTA)、L-3-(3,4-二羟基苯基)-2-甲基丙氨酸(L-DOPA)、考马斯亮蓝 R250、硫酸铵、苯硫脲、半胱氨酸(Cys)、柠檬酸、抗坏血酸，购买于国药集团化学试剂有限公司；4-甲基邻苯二酚、儿茶酚、苯酚、苯二酚，购买于北京索莱宝科技有限公司；5-Triton X-100、苯基-琼脂糖凝胶CL4B、DEAE CI-16B、琼脂糖6B，购买于南京建成生物工程；其它均为分析纯。

1.3 仪器与设备

CR21G冷冻离心机，购买于日本日立；立式压力灭菌器、Waring搅切器，购买于国华电器有限公司；TSK凝胶 SW3000色谱柱、DEAE-16B色谱柱、UV-2102C型紫外可见分光光度计，购买与上海生物工程有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 匀浆浸提法提取PPO

PPO提取按照郑斌等[11]人的方法，并略作修改。称取备用虾粉末样品100 g，设置料液比1:2 (W/V)，缓冲液pH 7.5，浸提4 h，水浴温度50 ℃，添加40 mL pH 7.5 的 Tris-HCl溶液，4 ℃下研磨后，静置 4 h，4 ℃环境下1000 g冷冻离心30 min，取上清液作粗酶液，并根据Bibhuti等[17]人方法计算PPO活性、蛋白质含量、回收率、酶比活和纯化倍数。

以4-甲基邻苯二酚为底物，添加0.88 mL 磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.05 mM)、0.1 mL底物(0.1 M)和0.02 mL酶提取液，制备成混合液，在420 nm 每隔30 s记录一次，共记录 3 min，计算每分钟平均吸光值，酶活单位就是引起每分钟吸收变化 0.1的酶量，PPO活力以Units/ml表示，产量以体积比（%）表示，酶比活以Units/(mg protein)表示，为方便计算每一步纯化后的酶产量，中华管鞭虾 PPO的总酶活被认为100%。

1.4.2 纯化

硫酸铵分级沉淀按照杨会成等[12]人方法并略作修改。粗酶液置于7个小烧杯于4 ℃冰箱内磁力搅拌，5～10 min内分别加入10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%研磨好的硫酸铵，再搅拌30 min，冷冻离心机4 ℃环境下10000 g离心30 min，收集沉淀，用pH 7.5 Tris-HCl缓冲液溶解。在4 ℃用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，0.05 mM)透析去除多余的硫酸铵。各样品分别取2 mL，测定各分级沉淀样品的酶活性和蛋白质含量。将活性较高质量分数片段范围的PPO混合后，冷冻干燥后-60 ℃保存。

DEAE离子交换层析前，首先将250 mL蒸馏水冲洗DEAE CI-16B琼脂糖柱材料(40 mL)，然后硫酸盐缓冲液(pH 7.5，2 mM)冲洗。超纯水稀释硫酸铵纯化品至700 mL (pH调至7.5)，与DEAE柱材料混合。在4 ℃保持慢速搅拌30 min，然后500 mL磷酸缓冲液(pH 7.5，2 mM) 冲洗2次后过柱，用梯度NaCl液(0～0.5 M，NaCl溶于pH 为7.5的2 mM硫酸盐缓冲液制备而成)进行梯度洗脱，别分收集后，透析除盐，测定各梯度洗脱样品的酶活力和蛋白质含量。合并酶活较好的部份，冷冻干燥，-60 ℃保存。

苯基琼脂糖凝胶疏水层析前，预先用50 mL蒸馏水以洗脱平衡苯基琼脂糖填柱料(10 mL)，然后 500 mL磷酸缓冲液(pH 7.5，2 mM)冲洗。取多酚氧化酶纯化品，超纯水将其稀释至15 mL，用25 mL 18%硫酸铵饱和(硫酸铵溶解于20 mM硫酸盐缓冲液中)，然后注射器8 Mpa缓慢匀速注入，50 mL磷酸盐(pH 7.5，2 mM)洗脱液按含18%～0%硫酸铵梯度顺序洗脱，收集洗脱样品。分别收集洗脱样品，透析除盐，测定洗脱样品的酶活力和蛋白质含量，合并酶比活较好的PPO纯化品，冷冻干燥后-60 ℃保存。

计算PPO活性、蛋白质含量、回收率、酶比活和纯化倍数，以粗酶液的酶比活为基准，每一步纯化后PPO增加的倍数被认为是纯化倍数。

1.4.3 底物专一性分析

按照吴亮亮等[16]人方法并略作修改。配制浓度为0.01 M的L-DOPA、儿茶酚、对苯二酚和苯酚。取1 mL酶液分别与2.5 mL的L-DOPA、儿茶酚、对苯二酚和苯酚混合后，再加入3 mL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，在50 ℃水浴加热10 min，在490 nm处测定其吸光值，绘制曲线。

1.4.4 以L-DOPA为底物的PPO动力学特性

以L-DOPA为底物，分别设置浓度为 0.01、0.05、0.10、0.15、0.2、0.3和0.4 M。取1 mL底物液与1 mL高效液相纯化酶液混合，45 ℃水浴10 min，490 nm处测定吸收值，计算酶活力，用 Lineweaver-Burk双倒数作图法绘制出PPO动力学曲线。

1.4.5 不同抑制剂和金属离子对 PPO活性的影响

将柠檬酸、抗坏血酸、苯硫脲、Cys、EDTA、CaCl2、MgSO4、CuSO4和 ZnCl2分别溶于 2 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，各抑制剂均配成12个梯度样品液，即0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1和0.2 M。

各取1 mL的抑制剂梯度液，分别加入1 mL高效液相纯化酶液，在4 ℃冰箱中抑制0.5 h，随后添加2.5 mL底物L-DOPA液、3 mL Tris-HCl缓冲液，在50 ℃下水浴10 min，加3 mL蒸馏水，终止反应。在490 nm处测定吸光值，阳性对照以1 mL的蒸馏水为参照，选取不同抑制剂和金属离子的最佳浓度所对应的酶活力数值作图。

1.5 统计分析

实验数据用Excel和Origin 7.0软件进行统计分析,结果以平均值±标准差(±sd)表示。

2 结果

2.1 纯化

图1 中华管鞭虾PPO纯化Fig.1 The profiles of PPO from Solenocera crassicornis

本实验采用匀浆浸提法从中华管鞭虾体内提取PPO的活力可达86.79 Units/(mg protein)。经硫酸铵分级沉淀、DEAE离子交换、苯基琼脂糖凝过滤纯化如图 1 (a)～(c)所示。

图1(a)表示粗PPO经硫酸铵质量分数10%～70%分级沉淀后的活性，结果显示，中华管鞭虾粗PPO的酶活集中在硫酸铵质量分数40%～60%，且显著高于其它质量分数，因此，收集该质量分数的PPO用于DEAE离子交换纯化。

图1(b)为经DEAE离子交换的PPO活性和蛋白含量，结果表明，PPO在pH 7.5条件下与DEAE色谱柱结合，0～0.5 mol/L盐浓度梯度洗脱后，洗脱峰出现在30～62号管且42号管为活性最高峰值，而在此范围，蛋白质含量不断增加，在42号管中出现最高峰值，随后下降。因而，收集PPO的活性较高的30～62号管中的PPO进行下一步纯化。

图1(c)表示经苯基琼脂糖凝胶过滤的PPO活性和蛋白含量。PPO洗脱峰出现在24～36号管且30号管的活性最高，蛋白质洗脱峰位于38～40号管。因此，收集活性较高的28～36号管，以用于下一步测试。

2.2 纯化结果分析

中华管鞭虾 PPO经过纯化后的结果所示如图 2(a-g)。结果表明，PPO的液体体积、蛋白含量和总酶活不断减少，而酶比活不断增加，回收率与纯化倍数之间呈负相关。硫酸铵分级沉淀、DEAE离子交换色谱层析、苯基琼脂糖凝胶过滤后的体积、产量、纯化倍数结果如表1，PPO的最终获得体积为3.7 mL，纯化倍数为25.9，而产量仅为1.2%。主要是由于每个纯化步骤后有目的的收集峰值区域的 PPO用于下一步的纯化，导致酶比活和纯化倍数增加，总酶活、体积、产量减少。

表1 纯化后的中华管鞭虾PPO纯化结果Table 1 The results of purified PPO from Solenocera crassicornis

2.3 底物专一性分析及动力学特征

以不同浓度的L-DOPA、儿茶酚、对苯二酚、苯酚为底物，研究部分纯化后PPO的底物专一性，结果如图3所示。PPO催化L-DOPA和儿茶酚催化作用较强，对苯酚和对苯二酚作用较小，因而本实验选取L-DOPA和儿茶酚作为PPO的特异性底物研究动力学特性。如图4(a)和图4(b)分别表示以L-DOPA和为底物的Lineweaver-Burk双倒数图所示，L-DOPA的Km值最低，为3.8 mM，儿茶酚8.12 mM。

图3 纯化后的中华管鞭虾PPO底物的专一性Fig.3 The substrate specificity of purified PPO from Solenocera crassicornis

图4 部分纯化后的中华管鞭虾PPO的动力学特性Fig.4 The kinetic properties and profiles of partially purified PPO from Solenocera crassicornis

图5 不同抑制剂和金属离子对部分纯化后的中华管鞭虾PPO活性的影响Fig.5 Effects of different inhibitors and some metal ions on the oxidizing activity of the purified PPO from Solenocera crassicornis

3 结论

3.1 匀浆浸提法能够使原料充分匀浆，增大虾体内PPO与浸提液的接触面，提高提取率[12]。浸提过程中，浸提时间的过久能使PPO与底物反应生成中间产物，中间产物的聚合可导致酶的沉淀和活力降低,降低了PPO的活性[9,14]。在本研究中中华管鞭虾PPO (4 h)酶比活可达86.79 Units/(mg protein)，略高于杨会成等人提取的PPO(3 h)，主要差异原因可能是本实验浸提时间较长。

3.2 生物体内丰富的酚化合物与 PPO结合生成不可逆结合，影响该酶的离子和疏水特性，干扰洗脱，给高度纯化过程带来了难度[7]。硫酸铵分级沉淀是纯化PPO的常用方法之一，杨会成等[12]人采用 10%～60%硫酸铵质量分数片段沉淀获取中华管鞭虾PPO，发现40%～50%质量分数范围活性较强，本研究采用硫酸铵质量分数片段为 20%～70%，40%～60%范围活性均较强，最佳硫酸铵饱和度为50%，可能中等质量分数更能诱导中华管鞭虾 PPO的构象变化而导致沉淀。另外，人们发现硫酸铵提纯虾PPO时，最佳质量分数片段位于低质量片段范围，比如凡纳滨对虾(40%)[9]、日本对虾(30%～40%)[13]，表明不同虾类提取PPO时，所采用的硫酸铵饱和度也不相同，进一步证实了沉淀PPO的硫酸铵饱和度依赖于种类[15]。本研究发现，除硫酸铵质量分数40%～60%以外，中华管鞭虾PPO在其他质量分数片段活性低，可能由于该PPO与酚类化合物的结合生成了非专一性沉淀的结果。经过DEAE离子交换色谱层析、苯基琼脂糖凝胶过滤纯化后，PPO的最终产量却仅占1.2%，而纯化倍数为25.9，高于凡纳滨对虾(2.4倍)[1]、日本对虾(19.4倍)[7]，可能由于不同种类虾体内含有不同种类和数量的酚类物，以及其与PPO产生不可逆结合程度存在差异，不同程度的干扰PPO纯化所致[16]，也可能与纯化技术、操作过程相关。

3.3 本研究发现，中华管鞭虾PPO对儿茶酚、L-DOPA具有较大催化活力，对 L-DOPA(Km为 3.8 mM 和R=0.982)、儿茶酚(Km为8.12 mM和R=0.991)具有高度相关性和较高亲和力，而对对苯二酚、苯酚氧化作用极低，推断其可能属于儿茶酚酶家族(EC 1.10.3.1)。此外，中华管鞭虾PPO对L-DOPA的Km值大大高于白对虾(2.8 mM)[2]、挪威龙虾(1.6 mM)[4]、美国龙虾(2.13 mM)[5]、凡纳滨对虾(0.81 mM和3.48 mM)[10,18]、黑虎对虾(4.45 mM)[3]以及日本蟳(3.41 mM)[17]，可能虾蟹类PPO的Km值大小与种类及其生境相关。

3.4 本研究发现，苯硫脲、抗坏血酸、Cys、Zn2+、Cu2+、柠檬酸、EDTA能抑制PPO活性，柠檬酸、苯硫脲、EDTA抑制最强，而Ca2+和Mg2+能增强其活性[18]。EDTA是一种专一性二价金属离子螯合剂，与PPO结合能抑制虾黑变[14]。EDTA对该PPO具有显著抑制作用，推断该中华管鞭虾PPO可能是一种金属酶。苯硫脲是Cu2+螯合剂，柠檬酸通过降低pH和螯合PPO活性区域的Cu2+而起到抑制作用[19]。苯硫脲能够通过螯合日本对虾体内的 PPO金属酶活中心的 Cu2+促使酶活丧失[2]。本研究发现，中华管鞭虾PPO对苯硫脲和柠檬酸较敏感，进一步表明该酶可能是一种活性部位含Cu2+的金属酶。本研究结果与日本对虾[13]、凡纳滨对虾[9]、龙虾[5]的报道的结果相一致，表明中华管鞭虾 PPO属于含有Cu2+的儿茶酚氧化金属酶。另外，Ca2+和Mg2+对PPO无任何抑制作用，反而增加了PPO的酶活力，与郑斌等[11]人研究符合，可能是 Ca2+和Mg2+作为中华管鞭虾 PPO的金属激活剂起着激活作用。本实验为控制中华管鞭虾PPO黑变提供有价值的基础数据。

3.5 本实验纯化了中华管鞭虾PPO，研究其动力学特征和PPO特性。研究发现，4 h提取时间的酶比活可达86.79 Units/(mg protein)，PPO的最终产量却仅占1.2%，而纯化倍数为25.9，以对苯二酚、苯酚、儿茶酚、L-DOPA为底物时，对儿茶酚、L-DOPA具有较大催化活力，对对苯二酚、苯酚氧化作用极低，柠檬酸、苯硫脲、EDTA抑制PPO活性最强，通过结果推断该PPO属于含有Cu2+的儿茶酚氧化金属酶家族。本研究能为控制中华管鞭虾 PPO黑变提供有价值的基础数据，为寻找廉价、安全、有效、新型的中华管鞭虾黑变抑制物质提供参考。