黑色素瘤分化相关基因-5及其抗体在炎性肌病的临床意义

田苡箫，李菁，王迁

作者单位：100032 北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科，风湿免疫病学教育部重点实验室

炎性肌病是一类异质性较大的自身免疫性疾病，特征为慢性肌无力、肌肉疲劳、骨骼肌中单核细胞和淋巴细胞浸润，包括多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)、包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)和嗜酸粒细胞性肌炎等。典型皮肌炎(classical dermatomyositis，CDM)指有近端肌无力、肌炎的客观依据、皮肌炎样特征性皮损的DM。此外，DM有一种特殊的亚型，即具有典型的DM皮疹，但在6个月之内无肌肉受累的临床和实验室表现(如肌肉活检、血清酶学和肌电图的异常)，称为无肌病性皮肌炎(amyopathic dermatomyositis，ADM)。有研究者进一步细分，将无肌病临床表现但是有实验室表现的DM称为轻微肌病皮肌炎(hypomyopathic dermatomyositis,HD)，将其与ADM合称为临床无肌病性皮肌炎(clinically amyopathic dermatomyositis，CADM)。

抗黑色素瘤分化相关基因-5(melanoma differentiation-associated gene-5，MDA5)抗体是一种首先发现于CADM中的自身抗体，常见于DM，在PM、系统性硬化症等其他疾病中偶有弱阳性的报道。成年人皮肌炎(adult dermatomyositis，aDM)与青少年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis，JDM)在临床表现、病理变化和发病机制上存在差异，因此拟分别阐述。

1 MDA5蛋白的概念

维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(retinoic acid-induced gene Ⅰ like receptor，RLR)是一类模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，是固有免疫系统中识别病原体的I型跨膜蛋白。MDA5、维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-induced gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)以及遗传和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetic and physiology 2，LGP2)都是RLR家族成员(图1)。

MDA5蛋白由解旋酶C域1诱导的干扰素基因(interferon induced with helicase C domain 1，IFIH1)编码，在绝大多数细胞的细胞质中表达，由1 025个氨基酸组成，相对分子质量为140 000，通过分子结构识别长度大于1kb的双链(double strand，ds)-RNA。MDA5包含以下5个结构域：N端由2个串联的半胱天冬氨酸激活和募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)负责向下游传递信号，中间为识别ds-RNA的DExD box解旋酶，C端是无活性的羧基末端结构域，可以结合ds-RNA(图1)。

MDA5与ds-RNA结合后，与线粒体外膜上的线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)通过双方各自的CARD相互作用而连接，从而募集于线粒体外膜上[1](图2)。MDA5-MAVS复合体的作用为：(1)与肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor rece-ptor-associated factor，TRAF)3结合，之后再通过与TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)等分子结合，使干扰素调节因子(inter-feron regulatory factor，IRF)3或IRF7磷酸化，进而使Ⅰ型和Ⅲ型干扰素(interferon，IFN)的合成增加，使100个以上的IFN刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)上调，从而引发宿主的抗病毒防御反应；(2)通过激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)而使编码促炎症因子和IFN的基因上调，激活NF-κB有多种途径，包括MDA5-MAVS复合体通过肿瘤坏死因子Ⅰ型受体相关死亡结构域蛋白与Fas相关死亡结构域蛋白、受体相互作用蛋白形成的复合体结合，MDA5-MAVS复合体与TRAF2或TRAF6结合等。

MDA5蛋白除了通过结合ds-RNA而被激活外，其编码基因(IFIH1基因)的获得性功能突变可以使其在无外源性RNA结合的情况下自发进行信号转导。当MDA5上第331位色氨酸被异亮氨酸或精氨酸取代时发生肌肉骨骼疾病(如Jaccoud关节病)及皮肤病(银屑病)的风险会增高[2]。

2 抗MDA5抗体阳性炎性肌病临床特征

MDA5抗体检测阴性者比较，抗MDA5抗体阳性DM在肺、皮肤、骨骼肌病变差异最为显著，RPILD发生率和死亡率更高，常有特征性的皮肤病变，肌肉症状往往无或较轻。因此有研究者认为可以将抗MDA5抗体阳性DM(包括经典皮肌炎和CADM)作为一个亚型。此外，抗MDA5抗体阳性DM的临床特征可能存在种族差异。

图 1 RLRs的分子结构示意图Fig 1 Scatter diagram of RLRs molecular structure

图 2 MDA5-MAVS激活的信号转导通路在皮肌炎发病机制中的作用Fig 2 Effects of signal pathway activated by MDA5-MAVS on pathogenesis of DM

2.1 抗MDA5抗体阳性炎性肌病患者肺间质病变的特点

Moghadam-Kia等人按照人口学特征进行1∶1配对纳入CADM和CDM成年患者各61例，以白种人为主，研究发现，与抗MDA5抗体阴性组相比，抗MDA5抗体阳性组患者急进性肺间质病变(rapid progressive interstitial lung disease，RPILD)和肺间质病变(interstitial lung diseases，ILD)的发生率较高，非RPILD的发生率较低而死亡率较高，肺功能也更差[3]。英国报道的JDM患者中抗MDA5抗体阳性率为9.5%(21/221)，可能低于日本的33.3%(18/54)，ILD和RPILD的发生率均较低[4-5](表1)。但是，Hall等[6]在对160例DM患者的研究中发现，11例(6.9%)抗MDA5抗体阳性患者中8例并发ILD，程度较轻，其中2例为RPILD，治疗后缓解。研究结果显示抗MDA5抗体与ILD有关，与RPILD无关。

表1 ILD、RPILD和RPILD在抗MDA5抗体阳性和阴性患者中的发生率[(ILD例数/抗MDA5阳性或阴性例数)，%]Table 1 Incidence of ILD,RPILD, and RPILD in the patients with anti-MDA5+ and anti-MDA5- (ILD number/ [anti-MDA5+ or anti-MDA5-],%)

2.2 抗MDA5抗体阳性DM皮肤病变、肌病及其他临床特点

与抗MDA5抗体阴性DM比较，抗MDA5抗体阳性DM患者特点如下：(1)皮肤溃疡的发生率较高[1,9-10]，且皮肤溃疡数目和深度与抗体水平可能呈正相关。Cao等[11]对15例抗MDA5抗体阳性DM患者进行观察，发现4例抗体水平>500 U/ml者出现多发溃疡，8例<500 U/ml者为单发浅表性溃疡，抗体水平最低的3例(<40 U/ml)均未出现皮肤溃疡。Fiorentino等[10]发现皮肤溃疡好发于Gottron疹、指腹、甲周及肘部，技工手、头皮及V区紫红色斑疹也比较多见。(2)肌炎表现较为轻微，抗MDA5抗体阳性者肌力得分较高，病理评分较低[5]，肌酸激酶升高的水平较低[12]。(3)Li等[12]的Meta分析发现，抗MDA5抗体阳性aDM患者中纵隔气肿、技工手、V字征、脂膜炎、脱发、关节炎或关节痛发生率较高。其他研究也发现关节炎发生率及纵隔气肿发生率较高[5,7,10，13]。(4)口腔溃疡较多见[5,10]。(5)手部水肿较多见[10]。(6)实验室检查显示血清铁蛋白、谷氨酰转移酶水平较高，CD4+T细胞减少，CD8+T细胞减少和CD4+/CD8+T细胞比例升高较为多见[7]，抗核抗体阳性率较低[7,13]，KL-6、LL-37和cfDNA水平较高[7](表2)。

3 MDA5与炎性肌病发病机制相关研究

3.1 炎性肌病中MDA5和抗MDA5抗体

Suárez-Calvet等[17]发现RIG-Ⅰ和MDA5在5例 DM患者的束周纤维中均过度表达，而仅在1例PM患者和1例包涵体肌炎患者的散在坏死肌纤维中过度表达。Allenbach等人发现抗MDA5抗体阳性DM患者的肌肉组织中MDA5的表达高于正常人，低于抗MDA5抗体阴性对照组[14]。Preusse 等[18]发现JDM患者肌肉组织中MDA5含量与正常对照组比较无明显差异，但是aDM则显著升高。

Sato等[19]于2005年对298例日本结缔组织病患者血清进行检测，在8例CADM患者中检出一种抗140 000多肽抗体，与该抗体检测阴性DM者比较，其发生RPILD的比率更高。2009年该研究者用互补DNA文库和免疫沉淀法确定了该抗体的靶抗原是IFIH1编码的MDA5[20]。抗MDA5抗体阳性不仅见于CADM患者，也可见于CDM，在东亚与欧美、东亚各族之间的阳性率存在差异，东亚人高于欧美人，汉族高于日本人(表3)。抗MDA5抗体为DM的特异性抗体，但在PM[9]、系统性硬化[15]、系统性红斑狼疮[7]、原发性干燥综合征[5]患者中也有该抗体弱阳性的报道。抗MDA5抗体还可见于部分慢性移植物抗宿主病患者，Lepelletier等[21]在接受异体造血干细胞移植的患者中检测出抗MDA5抗体(6/83)，受检的6例中有3例出现了DM样皮肤病变和RPILD，另1例ADM皮肤病变但是发生了RPILD，另2例既无DM样表现也无ILD，6例均无肌肉症状。抗MDA5抗体阳性组DM样皮肤病变和ILD的发生率高于抗MDA5抗体阴性组。

表2 抗MDA5抗体阳性与阴性的ADM流行病学特征、病理特征、器官受累、临床表现和转归的差异Table 2 Differences of epidemiology,pathology,organ damage,clinical manifestations, and progression between anti-MDA5+ and anti-MDA5-

表3 抗MDA5抗体在不同自身免疫性疾病的阳性率 [(抗MDA5+患者数/受检例数)，%]Table 3 Positive rate of MDA5 antibody in different autoimmunal diseases (anti-MDA5+ cases/total subjects,%)

抗MDA5抗体的水平可发生动态变化，在炎性肌病患者中可以转阴。Sato等[22]在10例并发RPILD且抗MDA5抗体阳性DM患者中发现，3例治疗有效的患者呼吸症状完全缓解时抗体水平下降到临界值以下，而4例死亡的患者中虽然有3例抗体水平下降，但是治疗前和死亡时的检测结果无统计学差异。Muro等[23]在CADM患者的治疗过程中观察抗MDA5抗体水平的变化，发现随病情缓解，9例患者抗MDA5抗体转阴，1例抗MDA5抗体水平下降到接近临界值，1例治疗3个月后死于ILD时抗体水平略有下降。Abe等[13]每2个月检测1次患者抗体水平，发现治疗的前2个月所有患者的抗体水平均下降，且程度无明显差异；2个月后存活者抗体水平持续下降(死亡者未行进一步检测)。此外，尚有部分患者虽然已进入缓解期，但抗体仍持续呈阳性。由此推测，抗MDA5抗体水平可能与并发RPILD的DM患者疾病活动度有关，可用来评估治疗反应，但治疗后抗体水平下降与预后的关系尚不明确。

3.2 MDA5及其传导通路对炎性肌病发病机制的影响

MDA5及其传导通路对炎性肌病发病机制的影响见图2及表4。

表4 MDA5-MAVS激活信号转导通路相关产物在抗MDA5抗体阳性和阴性DM患者中的差异Table 4 Differences of MDA5-MAVS activated signal pathway-related products in the patients with and without anti-MDA5

3.2.1 IFN途径： Liao等[24]发现，DM患者血清IFN-β水平和检测阳性率(35%)均显著高于其他肌病患者和健康人，但DM患者的血清IFN-α、IFN-ω水平和检测阳性率与正常组无明显差异。然而，Horai等[25]检测到抗MDA5阳性DM患者的血清IFN-α水平却显著高于抗MDA5阴性者，后者与健康对照组无明显差异，且IFN-α的水平与抗MDA5抗体的水平无明显相关；抗MDA5抗体阳性组、阴性组和健康对照组间IFN-β水平无明显差异。Rodero等[26]测得JDM患者血清IFN-α水平高于健康对照组。由此可见，IFN-α和IFN-β何者对DM的发病机制影响更大尚无定论，但是目前倾向于IFN-β的研究证据更多。IFN-β可以导致束周萎缩[17]、毛细血管内皮细胞受损[27]以及DM皮肤病变[28]，前二者是DM的特征性病变，损伤位于肌束边界和肌束膜的结缔组织，这种交界性病变在肌肉疾病中比较特异，也见于DM皮肤表皮层的角朊细胞[29]。Liao等[24]认为在DM患者皮肤中，IFN-Ⅰ基因标志物与IFN-β的关联大于IFN-α，他们在体外研究中观察到，当仅IFN-α或IFN-ω高表达时，功能芯片检测不到IFN-Ⅰ信号转导，由此推测只有IFN-β与干扰素基因评分具有相关性。

IFN-Ⅰ可以上调干扰素刺激基因(interferon stimulating genes，ISGs)，包括：(1)黏病毒抗性蛋白1(myxovirus resistance protein 1，MX1)，又称MxA：Uruha等[30]发现骨骼肌胞浆MxA诊断DM的敏感性为71%，特异性为98%；有皮肤症状无束周萎缩的DM患者中44%检测到MxA，17%检出膜攻击复合物，所以MxA是比束周萎缩和膜攻击复合物敏感度更高的DM标志物。(2)ISG15：是一种类泛素样修饰因子，可以与肌纤维和毛细血管中的多种蛋白质结合，导致束周萎缩。Preuβe等[16]发现在出现典型炎性肌病症状的DM患者骨骼肌中ISG15呈强阳性。(3)RIG-Ⅰ：Suárez-Calvet等[31]在50%DM患者的肌束中发现RIG-Ⅰ，检测到RIG-Ⅰ的患者中32%未见束周萎缩，但是在未检测到RIG-Ⅰ的DM患者中部分已发生束周萎缩。在PM等其他炎性肌病中，RIG-Ⅰ的检出率是11%，二者具有显著差异。(4)MDA5：见2.1[14,17-18]。

3.2.2 核因子-κB途径：核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)途径的产物较多且复杂，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(又称NOS2)、趋化因子等。Allenbach等[14]发现，抗MDA5抗体阳性患者与炎性束周血管交界的肌束中存在大量NOS2+纤维，与分子伴侣热休克蛋白70和神经细胞黏附分子有明显的共存关系，抗MDA5抗体阴性患者中无类似发现，由此推测NOS2对损伤的肌纤维有修复作用。Takada等[32]发现在并发ILD、抗MDA5抗体阳性的CADM患者的血清中抗MDA5抗体水平与趋化因子CX3CL1之间存在相关性。

4 小结

综上所述，MDA5及其抗体不仅通过多种途径参与了炎性肌病的发病过程，也可以作为炎性肌病特定临床亚型的生物标志物，在炎性肌病流行病学特征、实验室检查、病理特征、临床表现和转归等方面都有别于抗MDA5阴性患者，有可能会成为疾病活动度的监测指标。