CD47抗体对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用

戴有金　付鹤玲　鲍丹　郑媛　侯道荣

[摘要] 目的 觀察CD47抗体对异丙肾上腺素（ISO）诱导大鼠原代心肌细胞损伤的保护作用。 方法 分离培养40只1～3日龄的SD大鼠心肌细胞，使用ISO诱导原代大鼠心肌细胞损伤模型。采用随机数字表法将大鼠心肌细胞分为正常对照组（Control组）、模型组（ISO组）、治疗组（Anti-CD47+ISO组）。Control组，心肌细胞常规培养基培养；ISO组，常规培养基培养，加入ISO（10-5 mol/L）继续培养48 h；Anti-CD47+ISO组，常规培养基加入CD47抗体（7 μg/mL）培养12 h后，加入ISO（10-5 mol/L）继续培养48 h。测定培养细胞上清液乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量；使用Annexin-V与PI双染法及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率；超氧化物阴离子荧光探针（DHE）染色检测心肌细胞活性氧（ROS）水平；Western blot检测心肌细胞CD47、Bcl-2和Bax蛋白的表达。 结果 与Control组比较，ISO组心肌细胞的凋亡率明显升高（P < 0.01）；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO组可显著降低细胞凋亡率（P < 0.01）。与Control组比较，ISO组LDH、CK、MDA和ROS水平显著升高（P < 0.01），SOD和NO水平显著降低（P < 0.01）；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO组SOD和NO水平显著提高（P < 0.01），LDH、CK、MDA以及ROS水平显著降低（P < 0.01）。Western blot结果显示，与Control组比较，ISO组CD47和Bax表达显著升高（P < 0.05、P < 0.01），Bcl-2表达显著降低（P < 0.01）；相比于ISO组，Anti-CD47+ISO组CD47和Bax表达明显降低（P < 0.01），Bcl-2表达明显升高（P < 0.05）。 结论 CD47抗体可能通过抑制ROS的产生、调节Bcl-2/Bax蛋白表达比例来抑制心肌凋亡，从而对ISO诱导的大鼠原代心肌细胞损伤产生保护作用。

[关键词] CD47抗体；心肌细胞；异丙肾上腺素；抗氧化；抗凋亡

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（b）-0013-06

[Absract] Objective To investigate the protective effect of CD47 antibody on Isoproterenol （ISO） induced primary cardiomyocytes injury in rats. Methods The myocardial cells were isolated from 40 SD rats （1-3 days old）. The model of primary myocardial cells injury was induced by ISO. The myocardial cells of rats were divided into normal control group （control group）， model group （ISO group） and treatment group （Anti-CD47+ISO group） by random number table. In control group， myocardial cells were cultured in the conventional medium； in ISO group， the conventional culture medium was added with ISO （10-5 mol/L） for 48 h； in Anti-CD47+ISO group， CD47 antibody （7 μg/mL） was added to the conventional culture medium for 12 h， followed by ISO （10-5 mol/L） for another 48 h. Cultured supernatants were collected to measure lactic dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， superoxide dismutase （SOD）， malonadehyde （MDA）， nitric oxide （NO）； the myocardial apoptosis rate was detected using Annexin-V and PI double staining and flow cytometry； dihydroethidium （DHE） staining was used to detecte reactive oxygen species （ROS） in cardiomyocytes； the expression of CD47， Bcl-2 and Bax was detected by Western blot. Results Compared with the control group， the myocardial cells apoptosis rate in ISO group was significantly increased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the cardiacmyocyte apoptosis rate in Anti-CD47+ISO group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the control group， the levels of LDH， CK， MDA and ROS in ISO group were significantly increased （P < 0.01）， the levels of SOD and NO were significantly decreased （P < 0.01）； compared with the ISO group， the levels of SOD and NO in Anti-CD47+ISO group were significantly increased （P < 0.01） and the levels of LDH， CK， MDA and ROS were significantly decreased （P < 0.01）. The results of Western blot showed that compared with the control group， the expression of CD47 and Bax in ISO group was increased significantly （P < 0.05， P < 0.01）， the expression of Bcl-2 in ISO group was decreased significantly （P < 0.01）； compared with ISO group， the expression levels of CD47 and Bax in Anti-CD47+ISO group were decreased significantly （P < 0.01）； the expression level of Bcl-2 in ISO group was increased significantly （P < 0.05）. Conclusion CD47 antibody may inhibit myocardial apoptosis by inhibiting the production of ROS and regulating the expression rate of Bcl-2/Bax protein， thus playing a protective effect on ISO-induced primary myocardial cell injury in rats.

[Key words] CD47 antibody； Myocardial cells； Isoproterenol； Anti-oxidant； Anti-apoptotic

缺血性心脏病是全球发病率和病死率最高的心脏疾病。心肌缺血最终引起心肌梗死，是一种急性心肌损伤，其原因是缺乏足够的血液流向心肌[1]。氧化应激、心肌凋亡与心血管疾病包括心肌缺血和心肌肥厚有重要关系[2]。尽管临床护理改进，抗血小板、抗凝治疗和冠状动脉手术干预等治疗方法被使用，心肌缺血引起心肌梗死仍然是世界范围内死亡的主要原因[3]。

众所周知，β肾上腺素能受体介导的信号通路在调节正常心脏功能上发挥重要作用，然而β肾上腺素能受体的过量激活会导致心脏功能紊乱，其机制是氧化应激的增加诱导了心肌细胞的凋亡[4]。异丙肾上腺素（ISO）是一种合成的儿茶酚胺和β肾上腺素能受体激动剂，它能产生严重的心肌应激和梗死，会导致心肌依从性降低，心肌舒张和收缩功能抑制[5]。ISO引起的实验动物心脏病理学和形态学改变与人类缺血性心肌梗死的疾病特征极为相似[5]。有研究表明，使用CD47抗体阻断CD47信号，或者使用CD47敲除小鼠，可以减轻肝脏和心脏缺血/再灌注损伤，促进组织存活[6-7]。然而，CD47抗体对ISO诱导的大鼠心肌细胞损伤的作用鲜见报道。本研究拟使用ISO诱导大鼠心肌细胞损伤模型，从抗氧化及抗凋亡等方面探讨CD47抗体对ISO诱导的心肌损伤的作用，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生1～3 d的SPF级Sprague-Dawley（SD）乳大鼠40只，雌雄不限，购于南京医科大学医药实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（苏）2016-0002。动物自由饮食并置于恒定环境[温度（22±2）℃，湿度（50±5）%，12 h昼/夜循环光照]下饲养。

1.2 主要试剂

ISO（5984-95-2）和二甲基亚砜（DMSO，D8418）购自美国Sigma公司；DMEM高糖（11995-065）和胰酶（1869828）购自美国Gibco公司；超氧化物阴离子荧光探针（DHE，1890512）购自美国Invitrogen公司；乳酸脱氢酶（LDH，A020-1）、肌酸激酶（CK，A032）、超氧化物歧化酶（SOD，A001-1）和丙二醛（MDA，A003-1）測定试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（MTT）购自美国ENZO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（556547）购自美国BD Biosciences公司；CD47抗体（sc-53050）、Bax抗体（sc-7480）和Bcl-2抗体（sc-23960）购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；GAPDH抗体（5174）购自美国Cell Signal Technology公司。

1.3 主要仪器

普通细胞培养箱（HERACELL 150i），美国Thermo Scientific公司；细胞培养板，美国Corning公司；200目滤网（15-1070），Biologix公司；96孔多功能酶标检测仪（Eon），美国BioTeK公司；流式细胞仪（BD FACSVerse），美国BD Biosciences公司。

1.4 方法

1.4.1 乳鼠心肌细胞分离和培养 心肌细胞分离采用酶消化、差速贴壁法[8]。取1～3 d SD大鼠，使用75%乙醇浸泡消毒1 min后，取出心脏，去除心房；DPBS冲洗3次后剪碎心室肌；用0.125%胰酶多次消化成单细胞悬液；细胞悬液经200目滤网过滤，离心（1500 r/min，5 min，r = 13.7 cm）收集沉淀；用含10%胎牛血清培养基重悬细胞后接种于培养瓶中。37℃、5%CO2，孵箱中培养90 min；吸出心肌细胞培养液离心（非心肌细胞先贴壁），加入培养液（90% DMEM、10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL），以6×105/mL接种到6孔板，37℃，5%CO2，孵箱中培养；48 h后心肌细胞贴壁，更换培养基，以后每2天换液1次，培养3～4 d后用于实验。

1.4.2 分组与干预 使用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞随机分为正常对照组（Control组）、模型组（ISO组）和治疗组（Anti-CD47+ISO组）。Control组，心肌细胞常规培养基培养；ISO组，常规培养基培养，加入ISO（10-5 mol/L）继续培养48 h[9]；Anti-CD47+ISO组，常规培养基加入CD47抗体（7 μg/mL）培养12 h后[10]，加入ISO（10-5 mol/L）继续培养48 h。所有实验重复3次。

1.5 观察指标

1.5.1 心肌细胞活力测定 将心肌细胞按密度为105/mL接种于96孔板中，每组包含5个重复孔，按Control组、ISO组、Anti-CD47+ISO组分别抽取100 μL加入到对应的培养基中培养48 h，再于每孔加入0.5% MTT溶液10 μL，静置4 h，保留心肌细胞，并用PBS液漂洗2次，在每孔内入150 μL DMSO，在没有细胞的空白孔中加DMSO培养液，设为对照孔。振荡10 min后，在酶标仪中测量各孔的吸光度值（570 nm）。细胞存活率=（样品-空白）/（对照-空白）×100%。

1.5.2 心肌细胞凋亡检测 使用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测心肌细胞凋亡。心肌细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，分组处理结束后，收集培养液并离心后，低温保存。细胞用DPBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，收集细胞，离心后用AnnexinV-FITC结合液重悬，制成单细胞悬液，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）室温避光孵育10 min后，加入300 μL 1×buffer终止反应，混匀，流式细胞仪检测，数据分析使用FlowJo10.0.2软件。

1.5.3 LDH、CK、SOD、MDA和NO水平检测 收集各组细胞上清液，按照试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测LDH、CK、SOD、MDA和NO水平。

1.5.4 活性氧（ROS）检测 细胞使用DPBS洗涤3次；加入DHE（10 μm），37℃避光孵育30 min；DPBS洗涤3次后荧光显微镜拍照。

1.5.5 Western blot 采用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离、转膜。5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭3 h后，分别加入Anti-CD47抗体、Anti-Bax抗体、Anti-Bcl-2抗体和Anti-GAPDH抗体。4℃孵育过夜，1×TBST洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，1×TBST洗3次，增强化学发光法显色，凝胶成像系统拍照。使用Image J软件定量，使用GraphPad Prism软件作图。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞存活率比较

大鼠心肌细胞ISO处理明显增加了心肌细胞死亡，与Control组[（98.21±2.15）%]比较，ISO组[（48.59±3.68）%]心肌细胞存活率明显下降（P < 0.01）；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO组[（77.85±5.43）%]心肌细胞存活率显著升高（P < 0.01）。

2.2 各组心肌细胞上清液中LDH、CK的含量比较

ISO组心肌细胞CK和LDH水平明显高于Control组（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO组CK和LDH水平显著低于ISO组（P < 0.01）。见表1。

2.3 各组心肌细胞上清液中SOD、MDA和NO的含量比较

ISO组培养基上清MDA水平明显高于Control组（P < 0.01），SOD和NO水平明显低于Control组（P < 0.01）；Anti-CD47+ISO组培养基上清MDA水平显著低于ISO组（P < 0.01），SOD和NO水平显著高于ISO组（P < 0.01）。见表2。

2.4 各组细胞凋亡比例比较

与Control组比较，ISO组的细胞早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率均显著增高（P < 0.01）；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO組的细胞早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率则明显下降（P < 0.01）。见表3。

2.5 CD47抗体对ISO诱导的心肌细胞ROS产生的影响

为了检测Anti-CD47抗体是否可以减少大鼠心肌细胞ROS的产生，本研究使用DHE对细胞内产生的O2-进行染色（图1）。心肌细胞ISO处理明显使细胞产生更多的ROS；与Control组比较，ISO组ROS荧光更强；而CD47抗体封闭显著减少细胞ISO处理后ROS的产生；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO组ROS荧光明显减弱。

2.6 CD47抗体对ISO诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响

为了确定CD47下调对ISO诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响，本研究检测了CD47、Bcl-2和Bax的蛋白表达（图2A）。定量结果显示，ISO组Bcl-2表达较Control组明显下降（P < 0.01），CD47和Bax表达明显上升（P < 0.05、P < 0.01）；与ISO组比较，Anti-CD47+ISO组Bcl-2表达显著上升（P < 0.01），CD47和Bax表达显著降低（P < 0.01）（图2B）。

3 讨论

ISO为β受体激动剂，作用于支气管β肾上腺素受体，使支气管平滑肌松弛；作用于心肌β肾上腺素受体，增强心肌收缩力，缩短收缩期和舒张期。大剂量ISO则通过自身氧化而导致大量自由基的急剧生成和聚集，从而导致心肌缺血、缺氧，促使心肌结构及功能严重损伤，最终导致心肌细胞坏死，常用于心肌缺血损伤模型的诱导[11]。ISO诱导的急性心肌缺血损伤特征在人与大鼠上较为相似，故这种简便易行的方法常被国内外用于复制心肌缺血引起的心肌梗死实验动物疾病模型[12]。

CD47是一种具有五个跨膜域的蛋白质，在大多数细胞类型中广泛表达并参与免疫反应[13]。有研究表明在缺血状态下，CD47在血管细胞中显著上调[14]；CD47下调可以保护心脏压力，缓解心脏衰竭[15]；CD47还能减轻心肌梗死和缺血/再灌注损伤[16-17]。

通过细胞凋亡率以及细胞培养基中CK、CK-MB、AST、LDH含量的测定能够反映心肌细胞的损伤程度[7]。当组织坏死时，LDH及CK即可大量释放入血，其在血液中的活性随之升高[18]。本研究中ISO组心肌细胞的凋亡率以及培养基中CK和LDH的含量显著高于Control组，说明，ISO使心肌细胞发生严重损伤；CD47抗体使体外培养的大鼠心肌细胞CD47表达下调；具有抗氧化和减轻ISO的心肌细胞损伤的作用。

研究认为ISO引起的心肌缺血损伤与细胞内Ca2+超载和自由基大量产生有关。SOD、CAT以及GSH-Px等多种抗氧化酶组成了体内对抗自由基氧化损伤的防御系统，对体内氧化/抗氧化平衡的维持具有重要的意义[19]。细胞氧化应激主要由ROS介导，能够造成细胞内SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化物质被大量消耗，进而引起生物膜中脂质成分发生氧化并生产MDA[20]。正常情况下，ROS可被体内的抗氧化酶清除从而使细胞免受ROS的氧化损伤。当机体处于组织细胞缺血、缺氧时，ROS的清除系统功能会降低或丧失，从而造成细胞损伤[21]。氧化应激也是缺血/再灌注的主要病理表现[22]。本研究中，心肌细胞经ISO处理使氧化应激增加，并且降低了抗氧化能力。下调CD47不仅减少了超氧化物的产生，而且增强了心肌细胞SOD的抗氧化能力；CD47抗体还减少了ISO处理心肌细胞MDA的产生。这些结果说明下调CD47可减少ROS的产生以及增加抗氧化SOD酶活性。此外，ISO处理导致细胞培养基NO浓度的下降，CD47抗体会使NO浓度升高，这提示我们CD47抗体对心肌细胞的保护作用很可能通过增加NO的产生而实现。NO是生物活性气体，其作为血管内皮舒张因子，是体内重要的内源性细胞保护物质，可改善动脉内皮功能，舒张动脉血管，清除氧自由基，减轻心肌梗死和抑制凋亡，从而保护心肌细胞[22]。

心肌细胞凋亡是ISO诱导心肌损伤的标志，心肌细胞凋亡或细胞凋亡的过程会导致心肌功能衰退，最终引起慢性心肌病和末期心脏衰竭，导致预后恶化[23]。氧化应激在心血管疾病的发生发展过程发挥着重要作用，既可直接损伤细胞DNA诱导凋亡，还可以通过激活线粒体途径等间接方式介导细胞凋亡。氧化应激介导的心肌细胞凋亡是心肌梗死发病机制中的重要环节之一[19]。本研究中ISO引起心肌细胞的存活率急剧下降，Bcl-2表达减少，Bax表达增加；抗体封闭CD47则会显著抑制细胞的凋亡，Bcl-2表达增加，Bax表达减少。Bcl-2家族是在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的抗细胞凋亡基因，按其功能可分为抗凋亡的Bcl-2亚族和促凋亡的Bax亚族，心肌损伤会导致Bax蛋白表达增多[24]。在细胞凋亡信号转导途径中，Bcl-2家族成员的构成比例是凋亡调控的关键因素，Bcl-2/Bax在细胞凋亡过程中具有重要意义[24]。本研究结果提示，CD47抗体可能通过调节Bcl-2/Bax细胞凋亡蛋白比例，抑制细胞凋亡，保护缺血心肌。

综上所述，本研究结果提示，氧化应激在ISO诱导的心肌细胞损伤病理中发挥重要作用；CD47抗体可以通过调节ISO诱导损伤后心肌细胞的氧化应激作用，增加心肌细胞的存活率，抑制心肌细胞凋亡。CD47抗体在保护ISO诱导的急性心肌损伤上具有较显著的作用，有望应用于临床治疗。

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（收稿日期：2017-12-27 本文編辑：张瑜杰）