斑马鱼肿瘤模型的研究进展

李翠霞　苏秀兰

[摘要] 斑马鱼因具有体外受精、胚胎透明及繁殖能力强等小模式生物独特优势，近十年已经被广泛作为人类相关性疾病研究模型。目前针对斑马鱼的基因操作技术已相当成熟，靶向性地诱导或敲除体内某些基因，改变其表达水平，可以很容易地在斑马鱼上复制人类的一些肿瘤性疾病状态，因此适合建立斑马鱼各种类型肿瘤模型，并进行相关机制研究。本文就斑马鱼作为肿瘤模型的优势及斑马鱼各种类型肿瘤模型的研究做一综述，分析斑马鱼作为模式动物在抗肿瘤药物的研究中的应用价值。

[关键词] 斑马鱼；肿瘤模型；药物研究；应用价值

[中图分类号] R73-35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（b）-0022-04

[Abstract] Zebrafish have been successfully widely used as a research models for human-related diseases in the past decade due to their unique advantages in small-scale Organisms such as in vitro fertilization， embryo transparency and strong reproductive ability. At present， the gene manipulation technology for zebrafish has been quite mature， Targeting to induce or knock out certain genes in the body and change its expression level， it is easy to replicate some human tumor diseases on zebrafish， so various types of zebrafish tumor models can be established， and are suitable for conducfing reserch on related mechanisms. This article reviews the advantages of zebrafish as a tumor model and the research of various types of zebrafish tumor models， and the application value of zebrafish as a model animal in the study of anti-tumor drugs was analyzed.

[Key words] Zebrafish； Tumor model； Drug research； Application value

近年來，我国患肿瘤的发病率和死亡率迅速上升，为了进一步了解肿瘤的发病机制，明确其致病机制对人类健康十分重要。动物模型是研究人类疾病的重要工具。斑马鱼基因组和人类基因组有高度同源性，作为一种新型整体实验动物模型具有极大的优势。由于斑马鱼具有透明及繁殖能力强的特点，更易于用于开展肿瘤发生发展机制研究及肿瘤药物筛选，以及研究肿瘤生物学特性等工作。本文主要就斑马鱼作为肿瘤模型的优势及斑马鱼各种类型肿瘤模型的研究给予综述。

1 斑马鱼作为肿瘤模型的优势

斑马鱼是一种产于南亚的热带鱼，近年来被广泛应用于肿瘤的研究及药物的研发。作为一种新型的整体实验动物模型，与小鼠相比，斑马鱼具有以下优点：①斑马鱼胚胎发育在母体外进行，在受精24 h内许多器官已经发育，用显微镜可以实时活体观察。②胚胎透明，可以使用显微镜观察荧光标记的人类肿瘤细胞，这有助于我们更好地了解生物体内肿瘤细胞的行为，研究肿瘤生物学特性。③繁殖能力强。单个交配每周可产生数百个胚胎，可获得足够的胚胎以满足实验的需要。④斑马鱼可显著减少药物——肿瘤反应的时间，其中使用患者来源的细胞在治疗72 h后可成功获得药物反应数据[1]。与其他临床前模型相比，可以以更低的成本实时获得患者特异性疗法[2]。由于这些独特的特性，斑马鱼有助于推动驱动脊椎动物肿瘤进展的机制的研究，并提供以信息，以低成本和高效率的方式开发有前途的临床前药物。

2 各种类型肿瘤斑马鱼模型的研究

目前，斑马鱼作为肿瘤模式生物日益受到关注。国内外研究人员结合生物相关技术已相继利用斑马鱼建立了多种疾病模型。本文主要阐述白血病、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌及结肠癌等斑马鱼模型的研究。

2.1 斑马鱼白血病模型

白血病的体外研究和新药的研发都离不开实验动物模型，所有的脊柱动物都有发生白血病的可能。斑马鱼白血病模型的建立对于了解人类白血病的发生、发展及药物研究都具有重要的作用。2003年，Langenau等[3]首次建立T淋巴细胞白血病斑马鱼模型，向斑马鱼体内注入含编码淋巴细胞特异启动子rag2，驱动鼠源性c-Myc基因的表达，发现斑马鱼体内荧光标记的白血病细胞植入免疫缺陷的胸腺，提示原癌基因c-Myc参与斑马鱼肿瘤的形成。前期报道N-Myc蛋白是人类急性髓细胞白血病（ALM）预后不良的标志，而MYCN致癌基因在ALM中发挥作用的分子机制在很大程度上是未知的。Shen等[4]通过热休克蛋白启动子将小鼠MYCN基因引入胚胎斑马鱼，并建立了稳定的种系Tg（MYCN：HSE：EGFP）斑马鱼，利用外周血涂片检测，组织学切片和流式细胞仪分析肾脏和脾脏单细胞悬液，发现MYCN过表达使N-Myc蛋白增加，促进细胞增殖，增强骨髓细胞的再生活性和未成熟的造血细胞的积累，说明MYCN基因在AML的病因学中起作用。因此，可以利用MYCN转基因斑马鱼模型识别潜在的治疗靶点。卿恺等[5]为深入探讨Notch1基因在促进急性T淋巴细胞白血病发生中的调控机制，将构建的Rag2-ICN1-EGFP质粒显微注射到斑马鱼胚胎单细胞周期，并建立稳定传代的转基因鱼系。转基因F1代斑马鱼与在血管内皮增强型绿色荧光蛋白标记的斑马鱼系（flil-EGFP）比较，发现红细胞比例显著降低，淋巴细胞比例明显增高。说明转Notch1基因红绿双色荧光追踪的急性T淋巴细胞白血病斑马鱼模型已成功建立，同时，利用这种模型研究为抗急性T淋巴细胞白血病的新药提供了平台。

2.2 斑马鱼黑色素瘤模型

黑色素瘤是异常黑色素细胞过度增生引发的皮肤肿瘤，其恶性程度及死亡率非常高，是皮肤癌中最难治愈的肿瘤[6-7]。尽管目前黑色素瘤的发病机制及治疗方面的研究取得巨大成就，但黑色素瘤的发病机制与微环境相互作用等的研究具有具限性。黑色素瘤细胞通过与微环境相互作用，达到快速生长和转移的目的[8]。因此，建立活体斑马鱼黑色素瘤模型对黑色素瘤发病机制及抗黑色素瘤药物研究十分重要。Taylor等[9]建立了转基因mitfa黑色素瘤斑马鱼模型，研究mitfa基因在黑色素瘤的功能，使用正在发育中斑马鱼的延时成像显示，mitfa对细胞周期停滞与黑色素细胞分化至关重要，并强调mitfa活性水平在黑色素细胞状态中的重要性。研究者发现，在成鱼中，将mitfa保持在中等活性水平则很少自行导致痣，但与BRAFV600E结合以与p53突变相似的发病率促进痣和黑色素瘤的发展。该模型提供了mitfa在动物中与BRAFV600E结合的第一个体内证据。Santoriello等[10]為了检测癌基因在不同启动子调控下的作用，则利用Ga14-UAS途径建立了斑马鱼黑色素瘤模型，将UAS-HRAS转基因斑马鱼与Ga14启动子转基因斑马鱼进行杂交，利用囊胚移植模型研究，发现kita启动子可以驱动致癌HRASGV12基因在1～3个月发展成黑素瘤，且不需要肿瘤抑制因子突变的共同参与，而在HRASGV12基因的表达下mitfa启动子没有重现kita-GFP-HRASGV12表型，这可能与较低的HRAS转基因表达有关。Ablain等[11-12]最近利用斑马鱼开发了一种组织特异性CRISPR/Cas9系统，允许特异性敲除任何目的基因，结合MCR过表达和MCR敲除策略研究HEXIM在黑色素瘤形成中的作用。Tan等[13]将HEXIM鉴定为黑色素瘤中的一种新型肿瘤抑制因子，其在体内过表达能抑制肿瘤形成，而其失活则能加速肿瘤发作。这进一步了解对其肿瘤产生的影响，为药物的研发提供了基础。

2.3 斑马鱼肝癌模型

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一，2011年Zheng等[14]统计我国每年死于肝癌的人数为32.3万，病死率为23.93/10万，因此加强对肝癌的研究仍然是保障民生的重要任务。在过去几十年的研究中，虽然大量的致癌基因、抑癌基因都证明与肝癌的发生有关，但是对肝癌的了解仍然很有限，肝癌治疗效果仍不理想。从实验室研究到临床应用是一个艰难的过程，动物模型实验是肝癌研究的重要途径，也是临床治疗的重要参考。新加坡国立大学宫知远研究团队[15-17]通过多个与肝细胞癌相关的基因研究，分别构建出xmrk/kras或myc基因突变的转基因斑马鱼模型。该研究使用转基因斑马鱼稳定体内肝癌模型，以阐明kras基因驱动肝癌发生的机制。为了克服上述转基因鱼因致癌基因不可控制的持续表达所造成的应用局限性，Nguyen等[18]首次建立肝特异性肿瘤模型，利用肝特异性脂肪酸结合蛋白FABP10启动子在转基因斑马鱼肝脏中特异性地过表达致癌krasV12，研究发现高水平的krasV12表达可以引发肝癌发生，并且还发现致癌基因krasV12在肿瘤形成前阶段引发p53激活，进而抑制肿瘤的生长。为了验证斑马鱼肝特异性肿瘤模型构建成功[19]，向野生型斑马鱼成鱼中植入EGFP-KrasV12荧光标记的肝癌细胞，2个月后，正常的斑马鱼也发现肝癌细胞。xmrk或myc基因突变的转基因斑马鱼模型，经四环素诱导，xmrk或myc基因均显示过量表达，从而诱发肝组织增生以及癌变，四环素撤离后，肝脏肿瘤病变减弱[20]。这一发现模仿了人类肝癌的形成，为人类抗肝癌药物的研究提供了平台。Eeason等[21]构建转基因鱼转型，使肝细胞特异性过表达β-catenin，2个月后33%实验个体开始表现肝细胞癌，12个月后80%。利用该肝细胞癌模型进行药物治疗，发现了JNK信号通路抑制剂有助于减小癌变肝脏体积，这为肝细胞癌治疗提供了新的方案。

2.4 斑马鱼乳腺癌模型

乳腺癌是女性恶性肿瘤致死的主要原因，在世界范围内的发病率有上升和年轻化趋势。许多情况下，乳腺癌患者并不是死于原发肿瘤，而是因为转移引起其他并发症。虽然许多锯齿动物模型可用于体内肿瘤转移研究，但是费用高及周期长；而低成本的斑马鱼乳腺癌模型可快速获得肿瘤在体内转移的过程及检测药物的疗效。Ren等[22]利用显微镜将人乳腺癌MDA-MB-231细胞移植到转基因斑马鱼Tg（fli：EGFP）胚胎中，植入后不久，在荧光显微镜下观察荧光蛋白标记的乳腺癌MDA-MB-231细胞在活体鱼体内侵袭、转移的全过程，发现注射到卵周细胞空间的可以观察肿瘤周围和肿瘤内血管生成。结合细胞标记、微移植和荧光成像技术，能够快速评估肿瘤转移情况以响应药物的治疗。de Boeck等[23]利用斑马鱼乳腺癌异种移植模型研究了BMP信号在早期转移过程中的作用。将乳腺癌MCF10A M2细胞移植入斑马鱼Tg（fli：EGFP）胚胎中，观察BMP信号对侵袭和微转移的影响，通过稳定过表达抑制性Smad6（一种BMP特异性抑制性Smad）抑制人乳腺癌细胞系中的BMP信号传导，发现Smad6抑制BMP信号传导，显著增强体内乳腺癌细胞的侵袭。Li等[24]研究αv整合素在乳腺癌MDA-MB-231、MCF10A-M4细胞迁移中的作用，通过敲除乳腺癌MDA-MB-231和MCF10A-M4细胞中的αv整合素或用αv整合素拮抗剂GLPG0187，建立斑马鱼乳腺癌异种移植模型，在荧光显微镜下观察活体鱼体内乳腺癌MDA-MB-231和MCF10A-M4细胞的迁移情况，结果显示敲除αv整合素有效减轻乳腺癌细胞的迁移。Hong等[25]为了研究SHOX2对乳腺癌的作用，建立乳腺癌斑马鱼异种移植模型，结果表明SHOX2是乳腺癌中的转移促进蛋白。

2.5 斑马鱼结肠癌模型

随着生活节奏的加快，结肠癌的发病率及死亡率呈上升趋势。放射疗法显著降低直肠癌患者的局部复发，但远处转移的速度仍然很高。Snosa等[26]评估了AEG-1是否参与体外辐射增强的迁移和侵袭，将三种结肠癌SW480、SW620和HCT116细胞及各自稳定的AEG-1敲低细胞系注射到斑马鱼胚胎中，结果发现在所有AEG-1敲低细胞系中迁移和侵袭减少。此外，研究者观察到辐射增强了迁移和侵袭，而AEG-1敲除则消除了这种影响，并且发现在AEG-1敲低细胞中MMP-9分泌和表达降低。崔戈等[27]构建了BAMBl过表达融合红色荧光慢病毒载体感染结肠癌SW620细胞株，移植入肝脏特异性绿色荧光转基因斑马鱼Tg（Apo14：GFP）胚胎，通过荧光显微系统观察到结肠癌细胞在斑马鱼肝脏内转移情况，发现BAMBl基因过表达可显著促进活体结肠癌细胞发生肝转移，因此成功建立了一种基因修饰的结肠癌肝转移斑马鱼模型，为开发结肠癌肝转移治疗提供了一种新型的动物活体研究模型。

2.6 其他肿瘤斑马鱼模型

众所周知，斑马鱼是糖尿病和胰腺癌最好的模式生物。Schiavone等[28]为了鉴定调节侵袭性标志的候选分子（Notch和TGFβ）对胰腺癌的发病和进展情况，建立了斑马鱼胰腺癌模型，发现在胰腺癌的发病期间Notch信号传导途径上调，然后上调TGFβ/Smad3通路。Ignatius等[29]使用KrasG12D驱动的胚胎性横纹肌肉瘤模型（ERMS）的研究，强调起源细胞作为ERMS决定因素的重要性。使用转基因rag2-KrasG12D模型的动态细胞成像来追踪胚胎和成年斑马鱼中ERMS细胞亚群的进化，发现并揭示了分化的ERMS细胞在肿瘤生长中的新作用，并表明控制其稳态维持调节生长中的机制可能是开发潜在治疗方法的相关考虑因素。用类似的模型，Storer等[30]使用代表肌肉发育的各个阶段的启动子（cdh15、rag2、mylz2），推動KrasG12D的表达，并观察到源自更多祖细胞样细胞的肿瘤更具侵袭性。并发现这些肿瘤基于分化状态概括了人ERMS的亚组，并且在每个亚组中具有独特的信号传导途径。这些途径作为治疗靶点有待进一步研究，利用跨物种基因组学来指导治疗靶向的策略具有重要意义。

3 结语

虽然斑马鱼在肿瘤研究领域仍然相对不成熟，但其在体内成像、遗传易处理性和药理学测试的顺从性等特性为研究人员研究驱动肿瘤形成和肿瘤发展机制提供了独特的优势，为重大研究发现提供了新的途径，并为治疗开发和临床应用提供了模型系统。斑马鱼模型有望为肿瘤生物学和癌症药物开发做出巨大贡献。

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（收稿日期：2018-07-30 本文编辑：任 念）