慢性髓性白血病患者外周血细胞中SHP-1、DNMTs水平变化及其与疾病进展的关系

刘晓，刘珊，李英华

(哈励逊国际和平医院，河北衡水053000)

慢性髓性白血病为骨髓造血干细胞克隆性增殖所致的恶性肿瘤，占成人白血病的15%，全球年发病率为1.5/10万～2/10万[1,2]。酪氨酸激酶抑制剂是目前临床治疗慢性髓性白血病的一线方案，取得了较为瞩目的临床疗效，但仍有部分病例效果不佳且快速进展至加速期和急变期，生存周期大幅缩短[3]。欧洲肿瘤内科学会、欧洲白血病网均一致指出，慢性髓性白血病不同分期的基因表达存在着较大差异性，此种差异性是导致慢性髓性白血病急性转化的重要诱因[4,5]。本研究探讨了慢性髓性白血病患者蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)基因和DNA甲基转移酶(DNMTs)基因水平变化，并探讨了其与疾病进展的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年1月～2016年1月哈励逊国际和平医院收治的慢性髓性白血病患者80例(观察组),均符合中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016年版)相关标准。纳入标准：明确髓性白血病分期且无恶性肿瘤史患者；临床资料完整；患者以及家属知情且同意参加本次临床研究，签署知情同意书者。排除标准：多器官功能障碍综合征；处于妊娠期或哺乳期者。依据临床分期分为慢性期组35例、加速期组30例、急变期组15例。慢性期组中男22例、女13例；年龄27～65(48.10±1.14)岁；白细胞35.7×109/L～433.5×109/L(202.40±5.77)×109/L；血小板41.8×109/L～999.3×109/L(480.54±2.38)×109/L。加速期组中男19例、女11例；年龄28～64(48.07±1.13)岁；白细胞35.2×109/L～434.1×109/L(202.79±5.41)×109/L；血小板41.3×109/L～998.5×109/L(481.47±2.43)×109/L。急变期组中男9例、女6例；年龄30～63(49.11±1.11)岁；白细胞36.2×109/L～437.4×109/L(202.94±5.86)×109/L；血小板41.5×109/L～999.1×109/L(480.13±2.37)×109/L。体检健康者20例(对照组)，男11例、女9例，年龄30～63(47.10±1.22)岁。四组年龄、性别有可比性。

1.2 外周血细胞中SHP-1 mRNA、DNMTs(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)mRNA的检测 采用荧光定量聚合酶链式反应法。采集外周血后于EDTA管抗凝处理，等体积磷酸缓冲盐溶液稀释后2 500 r/min离心20 min后采集中间单个核细胞层，0.9%氯化钠吹打后静置5 min，1 500 r/min反复离心3次后提取样本总RNA。在冰浴中完成总RNA提取并进行逆转录处理，形成cDNA后加入由北京赛百盛公司设计合成的引物，SHP-1(414 bp)上游引物：5′-ACTTCTCCCCTTTGACC-3′,下游引物：5′-CTCAGGTACTGGTAATGCC-3′;DNMT1(227 bp)上游引物，5′-TCCACAGTGTTCACAGAGG-3′,下游引物：5′-CGGTAGTAGTCGAGTAGC-3′;DNMT3A(245 bp)上游引物：5′-GAAGCGGGCAAAGAACAG-3′;下游引物：5′-TCTTCCACAGCATTCAATTCC-3′;DNMT3B(165 bP)上游引物：5′-GCTCTTACCTTACCATCG-3′,下游引物：5′-GATACTCTGAACTGTCTCC-3′;采用SYBR Green荧光定量聚合酶链式反应对SHP-1基因、DNMTs基因(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)进行定量检测，结果以2-ΔΔCT表示。

1.3 外周血细胞中SHP1蛋白的检测 采用ELISA法检测。试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司，严格按照试剂盒操作说明操作，结果以OD值表示。

2 结果

2.1 四组外周血细胞中SHP-1 mRNA、SHP-1蛋白及DNMTs mRNA相对表达水平比较 外周血细胞中SHP-1 mRNA水平、SHP-1蛋白及DNMTs mRNA相对表达水平比较：观察组>正常组，加速期与急变期组>慢性期组，P均<0.05，加速期与急变期比较，P>0.05。见表1。

表1 四组外周血细胞中SHP-1 mRNA、SHP-1蛋白、DNMTs mRNA相对表达水平比较

2.2 外周血细胞中SHP-1 mRNA、DNMTs mRNA相对表达水平与慢性髓性白血病分期相关性 Pearson相关分析结果显示，外周血细胞中SHP-1 mRNA、DNMTs mRNA相对表达水平与慢性髓性白血病分期均呈正相关性(r分别为3.451、2.272、2.285，P均<0.05)。

3 讨论

慢性髓性白血病是目前全球范围内较为常见的一种恶性血液肿瘤，患者总数为120万～150万，且仍处于上升态势[6～8]。目前治疗该病症的手段多样，除了传统的化疗外，造血干细胞移植、酪氨酸激酶抑制剂亦有应用的报道[8,9]。然而，随着临床资料的日益丰富，仍有部分病例在接受上述治疗时出现急性转化情形，使得由该病症所致的病死率居高不下[10]。目前基因组DNA稳定性、白血病干祖细胞、髓系分化不畅、骨髓基质微环境改变、信号通路传导异常、表观遗传学异常已经被证实为慢性髓性白血病急性转化的主要诱因[11,12]。但随后的研究进一步指出，抑癌基因同样在该病症发生、演进中扮演着重要角色[13]。

SHP-1基因为胞质蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成员，既往又被称之为造血细胞磷酸酶，在机体中主要存在于造血细胞，能够通过对下游信号蛋白分子磷酸酪氨酸进行脱磷酸化处理而调控受体酪氨酸激酶、抗原受体复合物等信号通路，最终实现调控造血干细胞增殖与凋亡。近年SHP-1基因被认定为候选的抑癌基因之一[14]。正常生理状态下该基因以低表达呈现，当罹患包括慢性髓性白血病在内的恶性血液肿瘤后表达水平大幅提高。DNMTs基因在DNA甲基化中发挥着重要作用，DNA甲基化介导下CpG岛甲基化，继而抑制正常转录。此外，DNMTs基因还具有促进抑癌基因启动子甲基化的能力[15]。

本研究证实，外周血细胞中SHP-1 mRNA、SHP-1蛋白、DNMTs mRNA相对表达水平相比较：观察组>正常组，加速期与急变期组>慢性期组，加速期与急变期组相比较差异无统计学意义；Pearson相关分析提示，外周血细胞中SHP-1 mRNA、DNMTs mRNA相对表达水平与慢性髓性白血病分期均呈正相关。提示不同分期的慢性髓性白血病患者外周血细胞中SHP-1基因和DNMTs基因存在着较大的差异性，慢性期普遍低于加速期和急变期，而后两期又可被归纳为进展期，故可认定，SHP-1基因和DNMTs基因在该病症急性转变中扮演着重要角色；且表达水平越高，分期越高。然而，需要指出的是，SHP-1基因属于抑癌基因，而DNMTs基因具有促抑癌基因启动子甲基化的能力，在其作用下SHP-1基因表达水平将会升高，但二者之间是否同样存在此种正相关性，本次研究结果并不能加以肯定，尚需要今后大样本、多随机对照试验予以验证。综上所述，慢性髓性白血病患者外周血细胞中SHP-1基因和DNMTs基因的相对表达水平升高，以加速期及急变期为著，且两种基因相对表达水平与分期均呈正相关性。