低分子量肝素对大鼠SAP胰腺和肺组织形态学的影响

刘斌焰 ,邢雁霞 ,赵一锦 ,李 祥 ,李 婷 ,王 佳 ,刘斌钰 ∗

（1.山西大同大学医学院，山西大同037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所,山西大同037009）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是临床常见的急腹症，大约25%可转化为重症急性胰腺炎(Se⁃vere Acute Pancreatitis，SAP)[1]。SAP病变凶险、常伴有全身的多器官并发症[2-3]，因此死亡率较高。SAP是多病因疾病，与胰酶过度自身消化、胰腺微循环障碍、炎症细胞过度激活及肠道细菌易位等有关。低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWP）具有抗凝、抗炎、降血脂和免疫调节等作用[4]。课题组前期研究显示LMWP对大鼠SAP的肝和肾组织损伤具有保护作用[5-6]，本实验探讨LMWP对大鼠SAP胰腺和肺组织形态学的影响作用。

1 材料和方法

1.1 药品与动物

低分子量肝素为北京永康药业产品（15100501）；雄性Wistar大鼠，体质量400±25 g，购于北京维通利华公司。

1.2 试剂

牛磺胆酸钠为美国Sigma公司产品,血清TNF-a和IL-6试剂盒为碧云天公司产品,苏木精和伊红为北京中杉金桥公司产品。

1.3 仪器

冰冻切片机(Leica，CM1950)，台式冷冻离心机(D78532型)德国Hettich公司；酶标仪(ELX800型)美国BIO-TEK仪器公司。

1.4 方法

取雄性Wistar大鼠36只，采用牛磺胆酸钠制备SAP模型，造模方法参见文献[7]；造模后随机分为2组，模型组和低分子量肝素组（简称肝素组），模型组立即给予等剂量溶剂，肝素组给予低分子量肝素100 iu/kg，每日2次腹腔注射，0.1 mL/100 g每次；每组又分为术后6、12和24 h 3个亚组，6只/组。

1.5 组织标本制备

各组于术后6、12和24 h取胰腺和肺组织，置10%中性缓冲甲醛液中固定24 h，常规制成石蜡块切片，苏木精—伊红（HE）染色，供病理检测。光镜下采集术后6、12和24 h大鼠胰腺和肺组织图像，拍照并统计每个完整切面的炎细胞数；随机采集5个/张切片不重叠视野图像，借助Image-ProPlus6.0计算机图象分析系统完成。

1.6 生化指标检测

在术后6、12和24 h取血分离血清，用双抗体夹心法(ELISA)法测定血清TNF-α和IL-6含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 低分子量肝素对SAP大鼠胰腺组织形态学的影响

2.1.1 胰腺肉眼观察结果

大鼠ST造模后，在6、12和24 h时间点，模型组大鼠胰腺出现不同程度的出血或坏死样改变，胰腺及胰周组织出现皂化斑，伴血性腹水；肝素组大鼠胰腺出血或坏死程度、胰腺和胰周皂化斑及血性腹水均较模型组有不同程度的减轻。

2.1.2 胰腺组织病理学检查HE

染色结果显示，SAP模型组6 h胰腺小叶间隙增宽，排列不整齐，伴炎细胞浸润和出血；12 h胰腺小叶结构破坏，组织大片坏死，坏死区域腺泡结构消失；24 h胰周脂肪片状坏死，细胞玻璃样变、核溶解消失，坏死区有不同程度炎细胞浸润（图1A）。各时间点肝素组的胰腺腺泡小叶结构破坏、腺泡肿胀、腺泡细胞变性和胰小叶坏死程度较模型组明显减轻，可见胰岛结构，病变区域炎细胞浸润减少，随低分子量肝素治疗时间的延长，病变逐渐减轻（图1B）。

图1 大鼠SAP胰腺形态学变化（HE×400）

2.1.3 胰腺组织病理学评分标准

胰腺病理评分参考Kusske[8]标准，观察胰腺水肿、出血、坏死、炎细胞浸润情况并以此行病理学评分，见表1。

表1 胰腺组织病理学评分标准

2.1.4 胰腺组织病理学评分

得分=水肿+坏死+炎细胞浸润+出血。大鼠模型组与肝素组胰腺组织病理学评分，6、12和24 h不同时间t值分别为7.36、9.08、7.32，P＜0.001,见图2。

图2 大鼠SAP胰腺组织病理评分

2.2 低分子量肝素对SAP大鼠肺组织形态学的影响

2.2.1 肺组织肉眼观察的结果

模型组大鼠胸腔内可见多量的淡黄色或血性胸水，肺组织有不同程度出血水肿，并随时间延长逐渐加重；肝素组大鼠胸腔内见少量胸水，肺组织有轻度出血水肿，并随低分子量肝素的作用时间延长而减轻。

2.2.2 肺组织病理学检查

HE染色结果显示，SAP模型组6 h肺组织炎细胞浸润明显，肺间质有充血水肿及出血现象，12 h可见肺泡腔内出血明显，炎细胞浸润，邻近肺泡隔断裂形成肺大泡，24 h可见肺泡间隔增宽、肺泡萎陷和肺泡融合形成肺大泡（图3A）；肝素组的肺组织炎细胞浸润、出血等病理形态改变较模型组轻（图3B）。

图3 大鼠SAP肺形态学变化（HE×400）

2.2.3 肺组织病理学评分标准

肺组织病理评分参照Hofbauer等[9]标准对大鼠肺组织病理变化进行评分，以水肿、炎细胞浸润和出血程度、肺实质组织和空肺泡所占面积的百分比来判断肺损伤的程度。评分标准见表2。

表2 肺组织病理评分标准

2.2.4 肺组织病理学评分

得分=水肿+炎细胞浸润+出血+肺实质面积+肺空泡面积。大鼠模型组与肝素组6、12和24 h肺组织病理学评分t值分别为5.76、5.34、9.02，P＜ 0.001,见图4。

图4 大鼠SAP肺组织病理评分

2.3 低分子量肝素对SAP大鼠血清

血清TNF-α和IL-6的检测，采用ELISA相应TNF-α和IL-6试剂盒进行。结果见图5～6。

图5 大鼠SAP血清TNF-a比较

结果显示，术后6、12、24 h血清TNF-α水平肝素组与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）；术后不同时间血清IL-6的水平肝素组与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。

图6 大鼠SAP血清IL-6比较

3 讨论

低分子量肝素分子量低，平均为4 000～6 000，李介秋和范钦桥等[10-11]学者研究显示，LMWP抑制胰微血管内微血栓形成,同时还能使形成的微血栓溶解，从而达到改善胰腺微循环,减轻缺血-再灌注损伤和胰腺坏死。本实验结果显示：胰腺水肿、炎细胞浸润、出血和坏死以12～24 h最重，肝素组胰腺损伤程度比模型组明显减轻胰腺病理；肺组织病理结果显示肝素组肺损伤程度比模型组明显减轻。本结果提示低分子量肝素早期干预可减轻SAP胰腺和肺组织病理改变。程洁等[1]Meta分析结果显示，LMWP通过减少炎性介质释放，改善微循环，减少急性胰腺炎发展为SAP，减少并发症，降低死亡率。

TNF-a和IL-6均参与SAP炎症瀑布式级联反应，参与胰腺及肺等胰外器官损伤并起着重要作用[12]。本实验观察到TNF-a和IL-6水平从术后6 h开始升高，12 h继续上升，24 h出现不同程度的降低；在相同时间点肝素组与模型组比较，TNF-a和IL-6水平均下降（P＜0.001），提示低分子量肝素通过抑制血清TNF-a和IL-6的水平，可以减轻SAP胰腺和肺损伤。

4 小结

低分子量肝素降低血清TNF-a和IL-6水平，抑制炎细胞聚集，减轻全身和胰腺组织炎症反应，缓解胰腺和肺组织病变。