不同空间结构钛合金内植物在兔肱骨近端大结节处骨长入的组织学对比研究

李奉龙 薛喆 姜春岩

北京积水潭医院运动医学科（北京 100035）

人工肩关节置换目前主要用于治疗老年复杂肱骨近端骨折、肩袖损伤性关节病、重度骨性关节炎及类风湿性关节炎、重度创伤性关节炎等晚期肩关节疾患，关于其术后疗效各临床报道不一，术后最常见的并发症为肱骨大结节愈合不良，严重影响患者肩关节的术后功能[1]。目前临床上常用的人工肩关节假体主要为多孔涂层设计，虽然在一定程度上改善了骨-假体愈合状况，但仍存在一定的缺陷，如涂层与假体间的界面剪切力、低孔隙率及原电池效应等，均可影响骨长入状况，影响大结节的愈合[1，2]。既往研究证实，通过电子束熔融技术制备的经典正六面体孔隙结构钛合金内植物可以一定程度上克服传统涂层假体的缺点，改善骨长入效果。但正六面体结构与人体骨质的生理结构（骨小梁结构）并不相同[1]，而目前尚未有研究证实更加接近于人体骨质生理结构的骨小梁结构内植物是否更有利于加快骨长入的速度及面积，获得更好的术后生物力学强度。

本研究采用新西兰大耳兔进行动物实验，将骨小梁孔隙结构钛合金内植物（研究组）及经典孔隙结构钛合金内植物（对照组）植入兔肱骨近端大结节处，旨在通过组织学切片研究证实：①随着时间的演变，两种不同孔隙结构钛合金内植物在肱骨近端是否均具备骨长入潜能；②对比研究两组不同孔隙结构内植物植入骨质后，在不同时间点骨长入的组织学特点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

于2017年8月至2018年5月在本院动物实验室，将成年雄性新西兰大耳白兔30只随机分为2组，对照组和研究组，每组各15只，体重2.53～2.71 kg，兔龄4个月，单笼普通饲料喂养，术前观察2周，确认体健无疾病。实验过程对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.2 方法

兔肱骨近端内植物植入模型的建立：以速眠新Ⅱ注射液0.2 ml/kg对实验动物进行肌肉注射以施行全身麻醉，麻醉成功后将其置于左侧卧位。术区备皮、清洁，常规消毒，铺无菌单。在肩关节做长约2 cm的纵行皮肤切口。钝性分离三角肌，显露大结节，见图1左。于大结节止点处，使用2.0克氏针，穿过肱骨干的中心，并与肱骨远端长轴成约120°钻入，研究组沿骨道方向置入骨小梁孔隙结构钛合金螺钉，对照组置入经典孔隙结构螺钉（图2），建立肱骨近端不同空间结构钛合金内植物植入模型，如图1右。检查无活动性出血后逐层关闭伤口。

图1 骨长入模型建立

图2 不同孔隙结构钛合金内植物模型

1.3 造模后处理

观察家兔自然苏醒，常规进食。始终置于兔笼（65 cm×40 cm×40 cm）中限制活动，患肢不制动，造模后前3天，肌肉注射青霉素4×105 U预防感染。分别于术后3、6、12周这三个时间点对两组实验兔进行标本采集，每个时间点实验组与对照组各采集5只家兔。保留肱骨头至其远端3 cm的骨标本，去除所有肌肉以及软组织。使用中性福尔马林固定48 h，再使用梯度酒精（70%、80%、90%）脱水7天，100%脱水2次，每次2天。使用Technovit 7200VLC光固化树脂浸透1个月后，行光固化包埋。再应用德国EXAKT硬组织切磨系统制片（EXAKT 400 CS/AW Micro Grinding Sys⁃tem），平行肱骨干长方向切割，以解剖轴为中心，内外侧分别留有约1 mm骨组织，切成厚度大约为2 mm的标本后，行甲苯胺蓝染色。后于光学显微镜下，采用×4倍放大率进行图像采集。骨长入面积的测量使用Im⁃age-Pro Plus软件进行图像的处理分析。在矢状位切片上做一个可包含螺钉长径a和宽径b的矩形（去除螺母），则总面积S0=a×b，再计算出此矩形内可被甲苯胺蓝着色的组织面积S1，定义骨长入面积S%=S1/S0×100%（图3）。所有的组织学测量均由同一操作者完成。图3为经典孔隙结构内植物切片示意图。

图3 骨长入面积测量

1.4 观察指标

①定性观察：观察对比随着时间的演变，不同孔隙结构内植物骨长入的大体情况。②定量测量：对比研究在不同时间点（3周、6周、12周）两组不同孔隙结构内植物的骨长入组织学特点。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据由均值 ±标准差表示，评估研究组及对照组在3个时间点下骨长入面积百分比的差异，采用独立样本t检验进行分析。两组内的三个时间点采用ANOVA方差分析，其中P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物建模观察

30只兔术后健康状况良好，均于造模当天开始自主进食。观察期间无伤口感染。在建模操作过程中，家兔的肩关节局部解剖结构与人类相似，手术入路的相关解剖位置比较恒定，肩关节大结节生物型内植物植入模型的建立操作过程可重复性较高。

2.2 不同空间结构内植物骨长入情况随时间演变的大体变化情况

由镜下组织学切片染色大体来看，在3、6、12周这3个时间点，如图4所示，可见骨小梁孔隙结构螺钉及经典孔隙结构螺钉内软骨细胞数量均呈成正增长趋势，且分布的范围逐渐扩大。

图4 3、6、12周时骨小梁孔隙结构螺钉与经典孔隙结构螺钉的骨长入情况（局部）

2.3 不同孔隙结构内植物的骨长入百分比随时间的变化情况

30个样本的组织学测量结果如表1所示，组织学数据显示，在骨长入面积百分比方面，3周和6周时，骨小梁孔隙结构内植物（研究组）均显著大于经典孔隙结构内植物（对照组）（P＜0.05）；而12周时，两组间的骨长入面积百分比相比无统计学意义（P＞0.05）。两组内分别进行组内比较时，3周、6周、12周这3个时间点两两比较均有统计学差异（P＜0.05）。如表1所示。

表1 组织学测量结果

3 讨论

本研究通过组织学观察证实，不同孔隙结构内植物在兔肱骨近端的骨长入面积随时间均不断增加，早期（6周内）骨小梁孔隙结构内植物的骨长入速度显著大于经典孔隙结构内植物，但远期（12周）两组不同结构内植物骨长入面积并无统计学差异。

临床上目前常用的人工肩关节假体主要为多孔涂层设计，虽然在一定程度上可以改善骨-假体愈合状况，但其仍存在材料界面剪切力、低孔隙率及原电池效应等缺陷，无法达到真正意义上的骨长入[2]。因此，设计并研发具有三维空间结构的多孔材料假体，对于改善骨-假体愈合状况、提高假体固定强度，具有重要意义。目前已有的经典孔隙结构的钛合金金属是以钛合金为原料，采用电子束熔融技术制备成的新型金属材料，既往研究已经证实，以正六面体网格为基础单位向周围空间规律排布发散形成的经典孔隙结构螺钉有较好的骨长入特性[1]，本研究亦表明与人体正常松质骨骨小梁相似的“松质骨样”结构的骨小梁孔隙结构内植物具有与正六面体孔隙结构相似的骨长入特性，且在早期（6周内），具有更快的骨长入速度及更大的骨长入面积。这一发现也为临床治疗中选取不同孔隙结构的内植物提供了理论依据。

目前文献报道的影响人工肩关节假体置换术后大结节愈合的主要因素包括患者年龄、性别、骨质状况、假体的置入位置、肩袖质量以及假体类型[3-7]。临床上目前常用的人工肩关节假体主要为涂层设计，其主要原理是在假体近端制备多孔涂层，促进假体近端与大结节之间的愈合，理论上改善术后大结节的愈合状况。尽管如此，有临床多中心研究发现大结节的愈合率仍不能达到满意的效果[1，7-12]。本研究初步证实了不同空间结构材料的骨长入潜能与特性，为将来改善假体近端骨长入模块的相关设计，提高术后大结节的愈合率，提供了必要的理论及实践依据。

本研究所涉及的两种不同的空间结构材料均为立体发散结构，我们通过组织学研究初步证实了二者在骨长入方面的优势。相比而言，骨小梁结构的内植物在术后早期骨长入方面表现更为突出。与之相对应的临床意义在于，肩关节置换术后患者的早期康复锻炼。在本研究中，随着时间的推移，不同孔隙结构内植物在兔肱骨近端的骨长入面积均不断增加，早期（6周内）骨小梁结构内植物的骨长入速度显著大于经典孔隙结构内植物，但远期（12周）两组不同结构内植物骨长入面积并无统计学差异。目前临床上人工肩关节置换术后的康复在术后4～6周时常可开始进行主动辅助锻炼[13-15]，但也有文献质疑过早进行康复锻炼可能会干扰大结节的愈合过程，甚至导致术后失效[16]。而根据本研究结果，若术中采用骨小梁孔隙结构内植物相比经典结构内植物，可获得更好的骨长入特性。因此为增强患者术后早期的内植物-骨长入强度、尽早进行康复功能锻炼、提高术后疗效、降低术后并发症的发生率，采用新型骨小梁结构钛合金内植物或许在将来会成为更好的选择。

本研究还有以下不足：第一，实验动物样本量较小，饲养时间相对较短，缺乏长期研究结果；第二，缺少三维定量研究，仅为单一截面分析，缺乏三维重建体积分析。第三，本研究只进行了甲苯胺蓝染色研究，没有进一步的荧光蛋白染色研究以及相应的生物力学实验证实骨长入强度，因此还需要后续的免疫组化及生物力学研究进一步证实不同孔隙结构钛合金内植物的组化特性及生物力学特性。

4 结论

本研究通过组织学切片证实，不同孔隙结构内植物在兔肱骨近端的骨长入面积随时间均不断增加，早期（6周内）骨小梁孔隙结构内植物的骨长入速度显著大于经典孔隙结构内植物，但远期（12周）两组不同结构内植物骨长入面积并无统计学差异。