结核γ干扰素释放试验酶联免疫试管法和结核菌素皮试试验对行维持性血液透析合并结核患者的诊断和预后判断价值研究

李 洪，徐明芝，陈汝满，安 娜，白亚飞，黄 杏，王春莉，贺纪清，蔡 莉，曾 欣，韩丽珍

慢性肾脏病（CKD）患者进入尿毒症期前常因原发病接受免疫抑制剂治疗，多种原因可致细胞免疫和体液免疫低下［1-2］，是肺结核侵犯的主要人群。CKD患者感染结核杆菌后淋巴细胞功能低下，临床症状和影像学特点不典型、痰涂片阳性率低，常以肺外结核为主要表现，故诊断困难。尿毒症患者常就医晚、病情重、缺乏透析前肺结核筛查、以急诊进入透析，临床易将肺结核全身性症状与尿毒症全身性症状、水钠潴留、肺部其他感染混淆，导致结核诊疗延迟、病死率增高。因而如何早期诊断、早期治疗是防控CKD合并结核、改善患者预后的重要前提。

结核菌素皮试试验（TST）是结核辅助诊断措施，但TST阳性可以在非结核分枝杆菌感染、结核杆菌感染〔隐性结核（LTBI）和结核病〕和接种疫苗时出现，特异度低；MASHAIRAS等［3］在1996年发现的结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列，在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中缺乏，而RD1编码产生ESAT-6和CFP-10两种特异蛋白，其刺激机体T淋巴细胞产生特异性γ干扰素（IFN-γ），因而机体再次感染结核杆菌后可采用γ干扰素释放试验检测，其方法有γ干扰素释放试验酶联免疫试管法（QFT）和T细胞免疫斑点试验（T-SPOT）。有研究显示γ干扰素释放试验对维持性血液透析（MHD）合并LTBI/结核病的诊断灵敏度、特异度更高［4-6］，本研究旨在探讨海南省高流行病学情况下QFT和TST对MHD合并结核的诊断及预后判断价值。

1 对象与方法

1.1 纳入、排除标准 纳入标准：行MHD时间＞3个月；LTBI和活动性结核。排除标准：初次透析、未达到干体质量；不能按照要求完成相关检查；不愿参与研究。

1.2 研究对象 依据上述标准，选择2013—2015年在海南省人民医院血液净化中心行MHD患者198例为研究对象。患者均按照赫尔辛基宣言签署知情同意书。剔除拒绝行胸部CT检查者、首次TST阴性后未能在计划时间内进行二步法TST者、拒绝抽血进行QFT者，最终共156例患者完成研究。

1.3 LTBI定义 2015年世界卫生组织（WHO）将LTBI定义为结核杆菌抗原刺激引起的一种持续存在的免疫反应状态，临床无活动性结核表现，但目前无直接检测工具［7］。由于本中心长期反复结核暴露，本研究将胸部CT检查正常和陈旧性结核均视为LTBI，共纳入37例LTBI者。

1.4 菌阴肺结核诊断标准 依据中华医学会结核病分会2001年《肺结核诊断与治疗指南》［8］，菌阴肺结核为3次痰涂片及1次培养阴性的肺结核，诊断标准为：（1）有典型肺结核临床表现及肺部X线表现；（2）抗结核治疗有效；（3）临床可排除其他非结核肺部疾患；（4）结核菌素试验（PPD）（5 TU）强阳性，血清抗结核抗体阳性；（5）痰结核菌PCR+探针检测阳性；（6）肺外组织或肺部病理检查证实为结核病变；（7）支气管肺泡灌洗液（BALF）检出抗酸杆菌；（8）支气管或肺部组织病理证实结核病变；（9）具备（1）～（6）中3项或（7）～（8）中任何1项可确诊。依据中华医学会结核病分会《中国结核病分类法》［9］进行分类。

1.5 一般资料收集 研究开始时收集患者的一般资料，包括性别、年龄、透析龄、原发病、结核史、有无卡介苗（BCG）接种瘢痕、胸部CT检查结果、体质指数（BMI）、有无抗结核治疗、淋巴细胞分数。

患者均在研究开始3个月内完成胸部CT检查，按照检查结果分为4类：（1）正常；（2）陈旧性结核，或肺部纤维化、胸膜肥厚提示陈旧性结核；（3）肺部慢性感染病灶和/或不明原因多浆膜腔积液，或不明原因淋巴结肿大（肺部感染/积液）；（4）肺结核。其中（1）（2）依据本地区结核高流行、患者反复暴露情况归为高度疑似LTBI。之后每3～6个月复查胸部CT。

1.6 QFT 由海南维瑅瑷生物研究院提供试剂并完成试验。方法：采集3 ml全血，肝素钠抗凝，4 h内与试剂充分混合，37 ℃水浴箱孵育16 h后收集血浆，检测样品中IFN-γ含量，结果在中间值者再次取样直到区分出结果为止。

1.7 TST 患者先完成QFT后再完成TST，以避免先行TST唤醒结核抗原对淋巴系统记忆引起的QFT假阳性。采用两步法TST进行检测：皮内注射0.1 ml 5 U结核菌素纯蛋白衍生物，48～72 h后由3名有经验的护士测量皮丘直径，皮丘直径＞10 mm为阳性；阴性者1～3周后再次皮试取得增益效应后观察结果。

1.8 治疗 对透析充分、达干体质量、不明原因咳嗽超过3周、影像学检查显示肺部有慢性感染病灶和/或多浆膜腔积液，淋巴结肿大、消瘦、低热、乏力、促红素治疗低效或无效、顽固性贫血者按照疑似结核进行试验性抗结核治疗［9-12］；对LTBI者按照WHO推荐给予个体化抗结核治疗，记录疗效、不良反应［7］。记录抗结核治疗反应、药物调整；定期讨论病情进展。

1.9 预后 每1～3个月复查前清蛋白、C反应蛋白、血常规、BMI；3～6个月复查胸部CT，病情有急剧变化者随时调整复查频率。观察指标：（1）是否临床诊断为结核病、LTBI；（2）LTBI向结核病的转化率；（3）终点事件为死亡。

1.10 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以（s）表示，计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；影响因素分析采用多因素Logistic回归分析（前进法）；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验；死亡风险因素的分析采用Cox比例风险模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 本研究患者中男109例（69.9%）；有BCG接种瘢痕患者占73.1%；胸部CT检查正常19例、肺结核12例；其他一般资料见表1。

2.2 QFT和TST结果 MHD患者QFT阳性率为34.6%（54例），TST阳性率为67.9%（106例，见表2）。两种结果无一致性（Kappa值=0.053，P=0.405，见表3）。

2.3 QFT阳性影响因素的单因素分析 MHD患者中男性QFT阳性率高于女性，差异有统计学意义（P＜0.05）；无BCG接种瘢痕患者QFT阳性率高于有BCG接种瘢痕患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表1 MHD患者一般资料（n=156）Table1 Baseline clinical characteristics of the MHD patients

表2 MHD患者TST结果〔n（%）〕Table2 Results of TST in MHD patients

2.4 TST阳性影响因素的单因素分析 MHD患者中女性TST阳性率高于男性，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄段、胸部CT检查结果患者的TST阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表5）。

2.5 QFT阳性影响因素的多因素Logistic回归分析 以QFT是否为阳性为因变量，以性别、年龄、透析龄、原发病是否为糖尿病、结核史、有无BCG接种瘢痕、胸部CT检查结果、BMI、抗结核治疗情况、淋巴细胞分数为自变量（赋值见表6），进行多因素Logistic回归分析，结果显示性别、BCG接种瘢痕是QFT阳性的影响因素（P＜0.05，见表7）。

表3 TST和QFT阳性结果Table3 Positive results of QFT and QFT in MHD patients

表4 MHD患者QFT阳性影响因素的单因素分析〔n（%）〕Table4 Univariate analysis of the associated factors for positive QFT results in MHD patients

表5 MHD患者TST阳性影响因素的单因素分析〔n（%）〕Table5 Univariate analysis of the associated factors for positive TST results in MHD patients

2.6 TST阳性影响因素的多因素Logistic回归分析 以TST是否阳性为因变量，以性别、年龄、透析龄、原发病是否为糖尿病、结核史、有无BCG接种瘢痕、胸部CT检查结果、BMI、抗结核治疗情况、淋巴细胞分数为自变量（赋值见表6），进行多因素Logistic回归分析，结果显示性别、淋巴细胞分数是TST阳性的影响因素（P＜0.05，见表8）。

2.7 3年预后与生存分析

2.7.1 LTBI患者 37例LTBI患者，3年中19例（51.4%）于不同阶段在肺部出现慢性感染和/或积液病灶，其中11例经抗结核治疗有效，确诊为肺结核；5例死亡（其中2例死于呼吸衰竭）。

2.7.2 肺部感染伴/不伴浆膜腔积液者 107例肺部感染伴/不伴浆膜腔积液者中伴有不同程度咳嗽、消瘦、既往促红素治疗有效的贫血转无效、不明原因ESR明显升高、普通抗感染治疗无效高度疑似结核者88例，其中55例肺部病变加重。反复抗结核治疗45例，35例治疗有效，确诊为结核。停药原因主要是不良反应较大患者拒绝继续服药；抗结核药物不良反应主要为消化系统、神经系统、心血管反应，其中1例合并丙型肝炎者出现肝衰竭救治无效死亡，1例高血压、脑出血。

按照《中国结核病分类法》菌阴结核诊断标准［7］，本组患者结核患病率为42 948.7/10万，为本地区普通人结核患病率（539/10万［13-15］）的79.68倍（42 948.7/539）。本组患者胸腔积液/腹腔积液、心包积液患者55例，肺外受累51.89%。

2.7.3 3年生存曲线 第1年死亡16例，第2年死亡19例，第3年死亡12例，3年死亡共47例，生存率分别为89.7%、77.6%、69.6%（见图1）。3年粗死亡率（CDR）为301.3/1 000人。

表6 QFT阳性和TST阳性影响因素的多因素Logistic回归分析赋值表Table6 Assignmen of multivariate Logistic analysis of the associated factors for positive QFT and TST results

表7 QFT阳性影响因素的多因素Logistic回归分析Table7 Multivariate Logistic analysis of the associated factors for positive QFT results

表8 TST阳性影响因素的多因素Logistic回归分析Table8 Multivariate Logistic analysis of the associated factors for positive TST results

图1 156例MHD患者的生存曲线Figure1 Survival curves of 156 MHD patients

2.7.4 MHD患者死亡风险因素分析 MHD患者死亡风险因素的Cox比例风险模型分析显示，QFT阳性、C反应蛋白升高是生存的不利因素，抗结核治疗、前清蛋白是升高生存的有利因素（P＜0.05，见表9）。胸部CT检查结果正常者与纤维化/陈旧性结核、肺部感染/积液、肺结核患者生存曲线比较，差异均有统计学意义（χ2=6.193、8.615、9.640，P＜0.05）；纤维化/陈旧性结核与肺部感染/积液、肺结核患者生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=0.435、0.192，P＞0.05）；肺部感染/积液与肺结核患者生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=0.027，P＞0.05，见图2）。

3 讨论

中国2010年调查普通人群结核患病率为66/10万［13］，海南省为549/10万［14-15］，属中国的结核高发区。而尿毒症患者结核患病率目前尚无全国数据和海南省数据，多地区报道其患病率为正常人的4～30倍［16-18］。英国国家临床规范研究院（NICE）报告CKD、透析患者感染结核的RR是正常人的10～25倍，肾移植患者RR是正常人的37倍［19］。

LTBI的诊断往往没有直接证据。胸部X线检查显示既往有结核感染、TST阳性常被作为诊断依据，结核高发地区、与痰涂片阳性患者接触过者有额外高风险［7-10］。本研究仅有114例患者接种过BCG，漏接种率高；在校正其他因素的情况下，女性患者TST阳性率为男性患者的2.836倍；淋巴细胞分数每增加1个等级，TST为阳性的可能性增加3.573倍，即淋巴细胞分数低者BCG维持时间短，或TST反应需要足够的淋巴细胞；在校正其他因素的情况下，男性患者QFT阳性率是女性患者的3.45倍，与海南省流行病学男性结核高于女性情况一致［14-15］。有BCG接种瘢痕者QFT阳性率低于无BCG接种瘢痕者，说明接种BCG疫苗可能有效，但TST、QFT结果无一致性，即二者无关联。WHO已报告BCG时效为15～20年，对成人的保护价值尚有争议，TST阳性也可因在环境中接触获得，且BCG不能预防原发感染或潜伏结核的复活［20］。本研究临床诊断为LTBI者51.4%在3年内发展为活动性结核。

表9 MHD患者死亡风险因素的Cox比例风险模型分析Table9 Cox proportional hazards regression analysis of the risk factors for survive in MHD patients

图2 不同胸部CT检查结果MHD患者生存曲线Figure2 Survival curves of the MHD patients with different chest CT results

肺部CT检查在结核的诊断中至关重要，不同胸部CT检查结果患者TST阳性率间有明显差异，而QFT阳性率间无明显差异，提示依据QFT对于成年尿毒症结核病或LTBI无辅助诊断价值，与加拿大一项研究显示的不同胸部CT检查结果患者两种检查阳性率间均无明显差异不尽一致［21］。尽管有Meta分析提示QFT对MHD患者LTBI有较高诊断价值［22-23］，但其资料主要来源于结核低发国家，亚洲地区资料来源于中国台湾和新加坡，部分研究无肺部影像学资料；而海南省结核高流行、反复不规则抗结核治疗对此有干扰，LIANG等［24］和O'SHEA等［25］已经证实抗结核治疗2个月活动性结核或LTBI患者的IFN-γ均下降。除了常规抗结核药物以外，MHD患者因反复严重肺部感染住院，反复使用氟喹诺酮、阿莫西林克拉维酸钾、美罗培兰、利奈唑安等广谱抗生素，其均有抗结核作用，可使QFT滴度受到影响；而抗结核药物降低QFT滴度效应持续时间、恢复滴度时间、再次感染后升高时间未见报道。

QFT加胸部CT纵向追踪3年：（1）LTBI患者37例，3年中不同时期出现慢性感染和/或积液19例（51.4%），其中11例经抗结核治疗有效，确诊为肺结核；5例死亡（其中2例死于呼吸衰竭）；（2）依据胸部CT检查高度疑似结核者88例，其中55例肺部病变加重，反复抗结核治疗者45例，35例治疗有效，确认为结核。由于患者无咳嗽，或咳嗽不配合取痰，或惧怕病理检查的风险与花费，最终导致试验性抗结核治疗成为活动性结核的主要确诊手段，而抗结核治疗因药物不良反应而反复部分或全面停药，其价值有限，尽管如此，抗结核治疗者生存率仍优于未治疗者。

本研究Cox比例风险模型分析显示，QFT阳性、C反应蛋白升高是生存的不利因素；抗结核治疗、前清蛋白升高是生存的有利因素。胸部CT检查结果正常者生存率高于纤维化/陈旧性结核、肺部感染/积液、肺结核患者。

综上，在结核高流行区，在反复不规则抗结核治疗、广谱抗生素使用情况下，QFT阳性率男性高；接种BCG可降低QFT阳性率，但与TST结果无一致性；3年内LTBI转活动性结核比例很高；QFT阳性、C反应蛋白升高是生存的不利因素；抗结核治疗、前清蛋白升高是生存的有利因素。本中心MHD患者结核患病率为普通人的79.68倍。对于胸部CT检查发现异常且难于确诊的透析患者要认真追踪评估，必要时行试验性抗结核治疗；MHD合并LTBI、结核的诊断依然需要结合病史、结核易感因素、肺部影像学追踪、抗结核治疗反应进行［7-9，12，17，19，26］，同时需要大力推进组织病理、BALF检查。

志谢：感谢海南维瑅瑷生物研究院对γ干扰素释放试验酶联免疫试管法检测的大力支持。

作者贡献：李洪进行文献检索、课题申报、研究设计、研究组织、论文写作与修订；徐明芝、 陈汝满、 安娜、白亚飞、 王春莉、 贺纪清负责临床治疗、观察、基础数据整理；黄杏、蔡莉、曾欣进行结核菌素皮试试验与结果收集；黄杏进行数据汇总整理；韩丽珍负责统计学处理。

本文无利益冲突。