ICP-OES酶标仪法与国标法测定土壤全磷的比较

张丽萍 许丽卫 王久荣* 袁红朝 贺珍

摘  要：为了提高土壤样品全磷含量的检测效率，研究了电感耦合等离子体发射光谱仪（inductively coupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）、多功能酶标仪在土壤全磷含量检测的应用，并与国标法的测定结果进行了比较。结果表明，利用ICP-OES、多功能酶标仪测定土壤全磷结果可信，检测线性范围为0～100 mg/L、0～2 mg/L，r2>0.995，较国标法的0～1mg/L拓宽了检测范围;检出限为0.000015mg/L、0.0085mg/L，回收率介于95%～108%，这2种方法的测定结果与国标方法无显著性差异。本文为土壤全磷的检测提供了2种快速、高效的检测方法，对快速测试大量土壤样品的全磷含量，及时指导农业生产具有现实意义。

关键词：电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）;多功能酶标仪;紫外可见光分光光度计;土壤全磷

中图分类号：X142                               文献标识码：A                                          DOI：10.11974/nyyjs.20181032006

磷元素（P）是植物生长发育的必需营养元素，它以多种方式参与土壤系统内的各种代谢过程，为不可再生的矿质资源，是评价土壤质量的重要指标之一 [1-3]。传统国标方法采用钼锑抗紫外可见分光光度计法检测，存在样品pH、温度、显色时间、仪器无自动进样器等因素影响，对分析大量样品操作较复杂，耗时且工作量大[4-5]。随科学技术的发展，检测仪器日渐丰富，拓宽了磷素的测定技术[6-9]。本文依据磷素测定原理和仪器硬件原理，研究了ICP-OES、多功能酶标仪、测定随机选取不同地区土壤的全磷含量，比较了三者准确度、回收率、精密度和重复性，旨在为实验室日渐丰富的仪器拓宽检测项目提供技术性支持，增加磷元素含量检测手段，加快分析速度，减少试剂的使用，保护环境。

1     材料与方法

1.1     试验材料及主要试剂

供试土壤样品1-2号采自湖南桃源;3-4号采自广西环江;5-7号采自湖南洞庭湖湿地;8-37号采自湖南长沙近郊金井，样品经风干后过60目筛待用。供试仪器为紫外可见光分光光度计（Lambda 25，美国，PerkinElmer）、多功能酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士，TECAN）、电感耦合等离子体发射光谱仪（720 ICP-OES，美国，Agilent）。试验主要试剂：去离子水，无水乙醇、98%浓硫酸、NaOH、KH2PO4、酒石酸锑钾、钼酸铵、抗坏血酸等，所有的试剂均为分析纯。

1.2     磷素显色原理和仪器测定原理

磷素显色检测原理：在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物，在一定波长下，比色测吸光度定量。

紫外可见光分光光度计与酶标仪测定原理：紫外可见分光光度计与酶标仪工作原理基本相同，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液吸光度，根据朗伯比尔定律算出样品溶液的浓度。 酶标仪因取样量少现被广泛用于实验室检测。

ICP-OES测定原理：样品经处理制成溶液后，经自动进样器引入雾化器，经雾化室被载气带入温度达6000～10000K的等离子体焰矩，试样中组分被原子化、电离、激发，当这些激发态的粒子回到稳态时放出一定的能量（表现为一定波长的光谱）， 测定每种元素特有的谱线和强度，与标准溶液相比，就可对样品进行定性与定量分析。

1.3     试验方法

1.3.1     样品的消解

土壤样品按照国标方法（LY/T 1232-1999 森林土壤全磷的測定）消解，将所含磷素化合物全部氧化成正磷酸盐， 转移定容至50mL的容量瓶，混合均匀后，作为待测溶液。

1.3.2     紫外可见分光度计、酶标仪测定土壤全磷

吸取待测液5～50mL容量瓶，加入少量水，滴入2滴2，4二硝基酚后，用稀碱调pH至微黄，再加入5mL钼锑抗显色剂，室温下（25℃）放置 30h显色后，每份显色样品另取200uL至96孔酶标板;标准系列按50mL容量瓶中先分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL浓度为50mg/L的PO43--P标准溶液，各加5mL钼锑抗显色剂，去离子水定容，配制成浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ppm的标准溶液。在882nm 波长下，紫外-可见分光度计、酶标仪按照1.2中测定原理分别比色测吸光度定量。

1.3.3     ICP-OES测定土壤全磷

用去离子水稀释待测液10倍（0.5mL 待测液加4.5mL去离子水）直接上机进行测试。标准样品系列按50mL容量瓶中先分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和10 mL浓度为50 mg/L的PO43--P标准溶液，再加入与样品同等背景离子强度的对照溶液，后用去离子水定容。按照1.2 中ICP的测定原理，选择波长（214.914nm，178.222nm）下测定其响应值。

1.3.4     紫外-可见分光度计、酶标仪和ICP-OES测定土壤全磷的方法验证

1-7号样品的消解液，分别用标准加入法做回收率测定;用标准土样GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457同时处理3份做重复性试验，评价方法的准确度同一样品待测液分别在3台仪器上运行仪器上连续运行7次，评价方法的精密度。

2     结果与分析

2.1    紫外-可见光分光度计、酶标仪和ICP-OES标准曲线的制作及检测范围的确定

配制好用于土壤全磷测定的标准系列溶液后分别经3台仪器运行后， PO43--P浓度与仪器响应值（吸光度或离子强度）呈良好的线性关系，结果见表1。

2.2   紫外-可见分光度计、酶标仪和ICP-OES仪分析结果比较

由下表2可以看出，土壤样品经紫外-可见分光度计、酶标仪和ICP-OES分析仪检测，标准物质测定值均落在可信范围内（GBW07403其全磷含量为320±18mg/kg、GBW07404其全磷含量为695±28mg/kg、GBW07454其全磷含量为857±39mg/kg、GBW07457其全磷含量为493±27 mg/kg），3种仪器测定平均结果的相对偏差小于3%，按国标法方要求绝对偏差小于0.05%。结果表明，3台仪器的测定结果无显著差异。

2.3     准确度与精密度、回收率及检出限的测定

在不同土壤及土壤含量存在低中高差异情况下，通过外添加0.1、0.35、0.60 mg/L（0.70 mg/L）磷浓度（n=3）进行回收率测定，结果见表4。结果表明， ICP-OES和酶标仪测定7个待测土壤样品的平均回收率为95%～108%，与紫外-可见光分光度计测定结果无显著性差异。选择标准物质GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457，按照传统前处理方法做3份重复（n=3）待测液，分别经过3台仪器检测做重复性，一份进行7次测定做精密度及检测限，结果见表3。结果表明，ICP-OES和酶标仪测定4个标准土样待测液中磷浓度的重复性和精密性良好，相对标准偏差分别小于3.58%和3.81%，略差于国标法，这可能是与硫酸基质有关;检出限为0.000015～0.0085 mg/L，优于国标法。

2.4     实际样品方法验证

随机采取长沙近郊30个土壤样品，按照国标法前处理，经紫外-可见分光度计、酶标仪和ICP-OES分析仪检测，经比较ICP-OES、酶标仪测定结果与紫外可见分光光度计测定结果无显著差异，绝对偏差均<0.05%，结果见表5。

3     讨论

3.1     氢氧化钠熔融法测定土壤全磷的注意事项

由于不同地区土壤样品的pH以及金属元素含量存在差异，在采用氢氧化钠熔融后，某些样品按照标准方法加入7mL 1：3 硫酸转移，定容后溶液中仍会存在大量絮状物，这时要求续加硫酸，保证絮状物完全溶解，如若转移酸度不够，存在絮状物，会造成土壤全磷检测结果偏低，如广西环江部分碱土样品就存在这个问题。在利用磷素显色原理检测时，由于转移酸度不一致，需先对样品逐一调整pH，再加入钼锑抗显色剂显色检测。若是同一批次土壤转移酸度一致，有文献报道可以将钼锑抗显色剂的酸度调整为4.5N硫酸[10];磷素的显色反应受环境温度及显色时间相关性很大，冬天检测时需控制环境温度，提前开空调，或放入烘箱中保证显色温度达到25℃，可加快显色;为避免系统误差，标线制作与样品的显色pH、温度、时间需保持一致。

在利用多功能酶标仪检测样品时，由于酶标板是微量测定，所以样品与标样的微小体积不一致，对结果都会影响比较大。样品板本身有背景吸收，所以建议先做空白板的检测，再加入样品进行检测;检测为垂直检测，酶标板加入待测液时尽量一个方向缓慢打入，减少晃动及液体挂壁，保持液体厚度与标准系列一致。多功能酶标仪要求测试体积小于250uL，使用该方法可以减少试剂的使用及废液产出，有利于保护环境。

在利用感耦合等离子体质谱仪测定样品时，由于土壤样品经过氢氧化钠熔融，硫酸溶液转移，直接上机存在盐浓度大，硫酸密度大易积存矩管，基底背景干扰大，引起火焰抖动，因而需要将待测液稀释10倍后上机，由于存在钠离子的干扰且稀释后磷素浓度变低，因而仪器需重新延长积分时间从1s延长至3s，且配置的标准系列需要添加与检测样品一致背景的试剂空白。这也是影响ICP-OES测定土壤全磷精密度的主要原因，如若用湿法消解，RSD可以得到极大改善。

3.2     3种仪器各自优势

紫外可见分光光度计是标准方法要求的测定仪器，使用该方法工作量大，但精密度、重复性、准确度良好;酶标仪由于样品厚度容易变化，其精度没有紫外可见分光光度计高，需要多做平行，取平均值;但其少于2min就可以将一块96孔酶标板上的所有样品检测完，效率更高，而测定的待测液少于250uL，更加节约试剂，产出废液更少，更保护环境。ICP-OES分析仪在样品熔融转移后，稀释10倍可以直接上机检测，减少了显色反应这一步骤，仪器带有自动进样器，大大减少了工作量，且可以同时检测其他元素，如钾等，该方法可以用于大量样品快速测定。从数据结果看，其由于存在背景干扰及稀释因素的影响，RSD较紫外可见分光光度计法大，但如若改变样品前处理方式，如应用微波消解或硝酸高氯酸混酸湿法消煮等样品前处理方式，这个问题就迎刃而解，且同时可以快速检测更多元素，ICP-OES是现行大量元素测定的主要方式。

4      结论

本文按照国标法对标准物质土样及实际土壤样品进行氢氧化钠熔融前处理，经紫外可见分光光度计、多功能酶標仪、ICP-OES测定，结果表明：酶标仪、ICP-OES法测定土壤全磷的结果， 线性、精度、重复性、回收率、准确性良好，与国标法紫外可见分光光度计的测定结果基本能符合，无显著性差异，其结果均能满足全磷分析的准确度要求。因此，酶标仪、ICP-OES可以成为土壤全磷的分析检测仪器，与传统方法比较，这2种方法准确、简便、快速。鉴于植物样品硝酸高氯酸消解基质更简单， 酶标仪、ICP-OES也可以测定植物样品的全磷及其他元素。

参考文献

[1]总磷的测定.钼酸铵分光光度法，GB/T 11893-1989[Z].

[2]向晓黎，马小宁，魏向利.土壤全磷测定方法要点[J].农业灾害研究，2015，5（5）：30-31.

[3]包士旦.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，2005.

[4]文衍秋，郭烨，张国庆.土壤全磷测定中显色方法的研究[J].安徽农业科学，2013，41（6）：2442-2444.

[5]田翔，乔治军.糜子中全磷全钾含量的测定[J].山西农业科学，2016，44（8）：1092-1094.

[6]黄莹，方界群，卢颖材，等.连续流动分析仪快速测定甘蔗植株全氮、全磷含量[J].甘蔗糖业，2017（1）：57-61.

[7]吴玉萍，李应金，赵立红，等.连续流动分析法快速测定土壤中全磷、全钾的含量[J].西南农业学报，2013，26（5）：1941-

1945.

[8]陈璐，高玉花，毕建玲，等.ICP-OES测定土壤中全磷的应用[J].中国化工贸易，2014（32）：166.

[9]彭靖茹，甘志勇.微波消解ICP-OES同时测定土壤中的全磷和全钾[J].中国土壤与肥料，2009（3）：79-81.

[10]钱淑萍.土壤全磷测定方法讨论[J].新疆农业科技，2001（4）：    24-25.