曲克芦丁脑蛋白水解物对大鼠脊髓损伤后神经功能保护与修复研究

宋晓晖 于泰隆 陈滨晖 程实 吕松岑

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI） 是指由各种原因导致椎管内神经结构及其功能的损害，出现损伤水平及以下脊髓功能障碍[1]。SCI患病率在不同的地区差异较大，一项Meta分析显示中国SCI年患病率已达37人次/100万[2]。SCI往往导致损伤节段以下的感觉运动障碍，同时也可导致其他器官的功能障碍，严重影响患者的生活质量，对社会以及家庭造成沉重的负担[3]。在SCI早期，特别是损伤后8 h内，病变局限，如果药物应用得当，可最大限度地避免脊髓组织结构继发损伤，对脊髓功能恢复具有重要意义[4]。曲克芦丁脑蛋白水解物（troxerutin and cerebroprotein hydrolysate，TCH）注射液是一种复方合剂，多种成分协同增效，可同时作用于血管及神经细胞，进而保护损伤神经功能并促进其恢复[5]。TCH常用于治疗脑梗死等缺血性疾病，其可以多种形式作用于中枢神经系统，保护神经细胞免受进一步损害，减轻继发损害[6,7]。尽管已有研究探讨了TCH在治疗颈椎损伤高位截瘫的临床疗效，表明TCH注射液可促进脊髓神经恢复，但其作用机制仍不明确[8]。本研究拟通过“标准脊髓损伤打击装置”建立SCI大鼠模型，以此评价TCH对SCI大鼠脊髓神经功能的保护作用，探讨其保护的可能机制。

材料与方法

一、实验动物及实验材料

成年清洁级SD大鼠180只，体质量220～250 g，雌雄不限，由哈尔滨医科大学附属第二临床医学院动物实验中心提供。饲养条件：自由进食水，温度为21℃～28℃，相对湿度为40%～60%。曲克芦丁脑蛋白水解物注射液（吉林四环制药有限公司，批准文号：国药准字 H22026572）；曲克芦丁注射液（吉林津升制药有限公司）；脑蛋白注射液（吉林津升制药有限公司）。水合氯醛（成都市科龙化工试剂有限公司），防脱片剂、苏木素复染剂与伊红染液购自赛拓科技公司，伊文氏蓝（Aladdin阿拉丁生化科技股份有限公司），甲酰胺（哈尔滨医科大学附属第二医院），磷酸盐缓冲液、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）试剂盒与酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）试剂盒均购自Summus生物技术有限公司，自制SCI打击器。

二、实验动物分组及模型制作

1.实验分组：将大鼠按照随机数字表法分为5组，其中A组为假手术组，只进行椎板切除，不进行其他干预；其余4组SCI造模，切除椎板后制备T10 SCI模型；B组为空白对照组，术后使用1 mL生理盐水静脉注射；C组术后使用曲克芦丁注射液静脉注射0.0009 mL/g；D组术后使用静脉注射脑蛋白水解物注射液0.0009 mL/g；E组术后静脉注射TCH注射液0.0009 mL/g；C、D、E 组均加生理盐水配置成 1 mL注射液。各组依照对应药物术后当日开始进行尾静脉注射，1次/d，至各观察终点。

2.动物造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100g），麻醉成功后，将大鼠俯卧位放置在可调节恒温操作台上，定位水平位置中央，蚊式止血钳去除椎板进行开窗，大小约为2 mm×3 mm。自制压迫器（重量40 g）经过套管垂直压迫于脊髓之上，可见鼠尾痉挛性摆动，双下肢痉挛收缩，约20 s后完全松弛，证明模型制备成功，继续压迫5 min后撤除装置，庆大霉素盐水溶液冲刷创口，逐层闭创。术后3 d内，每日腹腔注射8×104U青霉素钠预防感染。

三、行为学评价

采用 Basso Beattie&Bresnahan（BBB）评分方法评估SCI大鼠后肢功能恢复状况，后肢全瘫为0分，完全正常为21分[9]。观察时点为术前、术后24 h、术后 3、7、14 d。

四、SCI大鼠脊髓组织学观察

1.脊髓组织HE染色：损伤后14 d，处死大鼠并将脊髓组织取出后，福尔马林固定，固定成功后修剪包埋。后切片制片、脱蜡、脱水，苏木精水溶液与酒精伊红染色液染色。

2.血液脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）渗透性检测：采用EB染料外渗法测定，即清醒状态下尾静脉注射2%EB染料（2 mL/kg），染料体内循环2 h[10]。麻醉后经心脏使用生理盐水灌洗，待右心耳流出液无颜色后解剖，以损伤段为中心取脊髓观察比较。

3.脊髓含水量（水肿）评估：使用过量麻醉处死动物后，迅速移除脊髓，将脊髓切成10 mm左右组织段，测量质量；然后迅速将组织放入100℃烘干器中，持续48 h，取出测量干质量，根据Elliot公式测量组织含水比：含水百分比（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100%[11]。观察时点为术后5、24 h及3 d。

五、脊髓组织AChE、ACP含量测定

麻醉后心脏灌注生理盐水，冲洗干净后取15 mm损伤段脊髓组织，按照相应试剂盒说明书步骤操作，通过酶联免疫分析分别测定AChE和ACP的含量。使用考马斯亮蓝测定总蛋白含量，结果表示为占总蛋白的含量（U/g）；测量的时间点分别是术前、术后当日、术后 3、7和 14 d。

六、统计学分析

采用SPSS20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（±s）表示，行为学测评采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠行为学BBB评分

术前各组BBB评分均为21分。术后，A组BBB评分与术前相同，任意观察时间点BBB评分均显著高于其余4组；B、C、D、E组 BBB评分术后均大幅降低，但随时间推移又逐渐增高。术后24 h B、C、D与E组BBB评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后 7、14 d，D、E 组高于 B、C 组，C 组高于 B 组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。详细信息见表1。

二、TCH对脊髓组织的保护作用组织学观察

1.脊髓组织HE染色：术后14 d，A组脊髓结构完整清晰，细胞形态正常，分布均匀；B组术后脊髓内有大量空腔，脊髓结构紊乱，有大量炎性细胞浸润，脊髓神经细胞水肿坏死；C组有空腔形成，形态较大，其炎性细胞浸润也较明显，可见脊髓神经细胞坏死。D组较A、B组炎性细胞浸润较少，细胞水肿较轻。E组炎性细胞浸润及水肿、坏死程度均较少，神经细胞存活较多，未见出血。详细信息见图1。

表1 脊髓损伤后不同时点各组大鼠BBB运动功能评分比较（n=5，±s，分）

表1 脊髓损伤后不同时点各组大鼠BBB运动功能评分比较（n=5，±s，分）

与 A 组比较，aP＜0.05；与 B 组比较，bP＜0.05；与 C 组比较，cP＜0.05。A 组：假手术组；B组：生理盐水组；C组：曲克芦丁组；D组：脑蛋白水解物组；E组：曲克芦丁脑蛋白水解物注射液组。

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2.EB含量测定：注射染料后可见大鼠皮肤、肢端及眼睛迅速蓝染。SCI大鼠损伤段，于5 h见轻微蓝染；于24 h、3 d时见大量蓝染；而A组脊髓未见明显染色。术后5 h，B、C、D、E组EB含量显著高于A组水平，E组EB含量显著低于D组水平（P＜0.05），差异均具有统计学意义。术后24 h及术后3 d，B、C、D、E组EB含量均显著高于A组；C、E组 EB含量显著低于B、D组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。 术后 3 d，B、C、D、E 组 EB 含量均显著高于 A组，差异具有统计学意义（均 P＜0.05）（图 2A）。

图2 血液脊髓屏障与脊髓水肿状况观察

3.脊髓含水量检测：A组含水量恒定，4组模型组脊髓含水量随时间变化逐渐增高，以术后24 h增高最显著，且E组增高趋势低于其余组。术后5 h，脊髓含水量各组间差异无统计学意义（F=1.9536，P=0.141）。术后24 h，脊髓含水量组间差异显著，具有统计学意义（F=368.004），B、C、D、E 组脊髓含水量均显著高于A组，C、D、E组脊髓含水量均显著低于B组；D组脊髓含水量高于C、E组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。术后3 d，脊髓含水量组间差异显著 （F=699.274），B、C、D、E 组脊髓含水量均显著高于A组，C、E组脊髓含水量均显著低于B、D组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

三、脊髓组织AChE、ACP含量

1.AChE含量测定：术前各组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后模型组AChE随时间恢复；术后当天，AChE含量组间比较差异显著 （F=618.432，P＜0.05），B、C、D、E 组脊髓 AChE 含量均显著低于A组；术后3 d，AChE含量组间比较差异显著（F=49.038，P＜0.05），B、C、D、E 组脊髓 AChE 含量均显著低于A组，D、E组脊髓AChE含量均显著高于B、C组；术后7 d，AChE含量组间比较差异显著（F=80.945，P＜0.05），B、C、D、E 组脊髓 AChE 含量均显著低于A组，D、E组脊髓AChE含量均显著高于B、C组；术后14 d，AChE含量组间差异显著 （F=56.754，P＜0.05），B、C、E 组脊髓 AChE 含量均与 A组比较差异显著，D、E组脊髓AChE含量均显著高于B、C组，E组脊髓AChE含量均显著高于D。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图 3A）。

2.ACP含量测定：术前各组间比较，差异无统计学意义（F=1.358，P＞0.05）。术后模型组 ACP随时间逐渐升高，但A组ACP无显著变化。术后当天，ACP含量组间差异无统计学意义（F=0.531，P=0.714）。术后 3 d，ACP 含量组间差异显著（F=15.481，P＜0.05），B组脊髓ACP含量均显著高于A、C、D、E组，C组脊髓ACP含量均显著高于A、D、E组；术后7 d与14 d，ACP 含 量 组 间 差 异 显 著 （F=14.843、F=19.468），B、C、D、E 组脊髓 ACP 含量均显著高于 A组，D、E组脊髓ACP含量均显著低于B、C组。以上差异均具有统计学意义（均 P＜0.05）（图 3B）。

图3 脊髓组织AchE与ACP表达水平

讨 论

SCI是中枢神经系统损伤的一种，可分为原发性损伤和继发性损伤，其中神经细胞的凋亡是导致脊髓损伤的重要机制之一。TCH注射液对SCI模型大鼠有良好的治疗效果，体现在行为学的改善、血液脊髓屏障结构和功能的稳定、脊髓受损细胞的保护，以及ACP生成的抑制、脊髓组织中AChE水平的恢复加速。

在SCI动物模型的运动功能评价中，BBB评分用于SCI大鼠后肢运动功能恢复过程评价，与SCI的程度高度相符[12]。本研究中，通过BBB评分发现TCH可促进SCI大鼠后肢运动功能的恢复，提示TCH注射液有助于SCI大鼠的脊髓神经功能的再生、修复和重建，有助于运动功能的恢复。在临床实践过程中，TCH也已被证实可加快脊髓恢复的过程[8]。关于TCH对中枢神经功能的治疗与保护，多项关于脑卒中的临床研究有所验证，其可促进神经功能恢复，改善脑梗死患者的神经功能缺损程度，改善患者的生存质量[13,14]。这与本研究中TCH可促进SCI大鼠后肢功能的恢复结果是一致的。

关于血液脊髓屏障的保护，本研究观察了TCH对SCI大鼠脊髓BSCB及脊髓水肿状况的影响，结果发现TCH与曲克芦丁均可有效地减少脊髓组织的EB含量，提示TCH注射液可以降低BSCB渗透性的改变，这可能与曲克芦丁可降低毛细血管通透性，改善微循环有关[15,16]。在对SCI大鼠脊髓水肿状况的观察中发现，曲克芦丁与TCH注射液干预组，术后24 h和术后3 d脊髓组织含水量均显著低于其他干预组，术后3 d脊髓含水量达到较高水平。这与临床中SCI发生后2～3 d内损伤部位水肿迅速加重一致，原因可能在于脊髓水肿会加重神经元缺血、缺氧，又进一步加重水肿[17,18]。现已证实，曲克芦丁可改善静脉功能、降低因各种原因而升高的毛细血管通透性，以此延缓或改善水肿的发生[15,16,19]。因此在对SCI大鼠BSCB与脊髓水肿状况的观察中，曲克芦丁组与TCH组状况均优于生理盐水组与脑蛋白水解物组。

胆碱能神经介质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）的水解酶AChE，其主要生物学功能是水解ACh，保持神经冲动的灵敏性[20]。在胆碱能神经元中AChE的含量与ACh的合成呈平行关系，检测AChE可间接提示ACh的含量[21]。在脊髓损伤后，两者含量均会降低[22]。本研究发现SCI大鼠的脊髓AChE的含量显著减少，并随时间的变化恢复；而TCH组AChE的恢复速度显著快于其他干预组，术后14 d已接近正常水平；脑蛋白水解物组，AChE的恢复速度也比较良好，但次于TCH组。结果提示曲克芦丁可协同脑蛋白水解物促进胆碱能神经元功能的恢复，可能的机制在于TCH作为曲克芦丁和脑蛋白水解物组成的复合制剂，含有多肽、氨基酸等物质，可增强神经胶质细胞间缝隙连接通讯的作用；曲克芦丁可抑制血小板聚集，防止血栓形成，降低血黏度，改善微循环等作用；曲克芦丁协同脑蛋白水解物，增强了脊髓神经元的恢复能力[5,23,24]。酸性磷酸酶ACP普遍存在于多种细胞的溶酶体中，是溶酶体的标志酶，代表着溶酶体膜渗透性的高低，其含量与活性变化可反映细胞的损伤程度。大鼠脊髓损伤后，ACP含量开始逐渐升高，表明溶酶体数量增加及功能活跃、膜渗透性增高，神经元损伤加重[25]。本研究也发现，TCH干预的SCI大鼠ACP含量随时间上升趋势明显低于其他组，提示TCH可抑制ACP含量的上升，对神经细胞有保护作用。SCI过程中无论是继发性还是原发性，均造成脊髓的缺血缺氧；缺血缺氧状态可导致神经元内AChE含量、活性的减弱和ACP含量、活性的增强，随着缺氧状况的改善，这两种酶的活性和含量又呈逐渐恢复趋势[25]。这一结果与本研究基本一致。

综上所述，本研究证明了TCH可能通过增强BSCB的稳定性，减轻SCI的水肿，保护受损脊髓神经细胞，抑制ACP的生成、加快AChE的恢复速度，从而达到对SCI大鼠脊髓神经功能的保护作用。然而，中枢神经损伤研究多涉及到神经元-胶质细胞-血管等几部分，而本研究从行为学、组织学与分子水平探讨了曲克芦丁脑蛋白水解物对脊髓神经功能的保护，未对血管与胶质细胞层面进行深入的探讨，其具体作用机制仍待进一步研究。本课题后期将更加深入地探讨曲克芦丁脑蛋白水解物的作用机制，并在此基础上进行相应的临床研究。