Toll样受体4基因缺失导致小鼠运动平衡障碍

朱健伟 李益飞 王兆涛 贾伟强 陈晨 汪继 顾应江 徐如祥

哺乳动物的小脑在运动平衡中发挥着关键的作用，当机体出现小脑功能障碍时，常常表现为步态不稳、协同不能、测距不准等运动失调。“三明治样”结构的小脑皮层，是小脑功能执行的解剖基础，而位居“三明治”结构中央蒲肯野细胞层（Purkinje cell layers，PCL）的蒲肯野细胞（Purkinje cell，PC）是小脑皮层唯一的信号输出神经元，对于小脑功能的执行具有不可替代的作用[1]。PC通过其伸向外侧分子层的树突，接收平行纤维和爬行纤维传递而来的信号，经整合后传递到前庭小脑核和深部小脑核，从而完成小脑功能的执行。

Toll样受体-4（Toll-like receptor 4，TLR4）是 Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族的 4 号成员，在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞中[2,3]。近年来TLR4逐渐被发现在神经前体细胞（neural progenitor cells，NPCs）和神经元中也有表达，既参与了成年海马区的神经发生，同时对于神经可塑性的调节也具有重要的作用，其功能作用涉及到神经损伤后的修复以及神经退行性病变的发生发展[5-7]。而笔者最新研究证实，TLR4在小脑PC中高度表达，但其在小脑功能中的作用却不甚明确[8]。考虑到小脑在运动平衡功能中的重要作用，本研究拟在前期研究的基础上进一步深入探索TLR4在小脑运动平衡功能中的作用。

材料与方法

一、实验动物

本实验以6月龄大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窝对照的野生型（TLR4+/+）小鼠作为研究对象。TLR4-/-小鼠购自南京大学动物模式中心。经与野生型的小鼠杂交后得到杂合子（TLR4+/-）小鼠，然后通过TLR4+/-小鼠交配繁殖得到实验所用的TLR4-/-小鼠和其同窝对照的野生型小鼠。实验所用小鼠均饲养于12 h昼夜周期的标准SPF级的实验动物房内，并给予充足的水和食物。

二、实验试剂及仪器

莱卡冰冻切片机（CM1950，德国）；加速转棒实验仪（LE8505，Bioseb 公司，美国）；梯踏步实验仪（Bio-FMA，Bioseb 公司，美国）。

三、方法

6月龄大小的TLR4-/-和其同窝对照的野生型小鼠被用于行为学测试，测试时间均为9:00～17:00，所有行为学实验进行过程中，测试者均不知道受测小鼠的基因型，所有数据由另一个同样不知道小鼠基因型的分析者进行分析。受测小鼠（野生型组10只；TLR4-/-组11只）依次进行足迹实验、加速转棒实验和梯踏步实验。

1.足迹实验：受测小鼠的前后脚趾分别用红色和黑色的无毒墨水涂抹后，自行通过一条垫有白纸的通道（70 cm×10 cm×10 cm）。每只受测小鼠在3次证实测试之前均经过3次预实验。每次所得的足迹，取6个连续的足印进行分析，每个点以脚趾中部为参考点。同侧两个后脚足印之间的距离作为步长；后脚足迹到对侧下一个后脚足迹之间的垂直距离作为步宽。后脚足迹到同侧前脚足迹之间的距离作为肢体间协调。每一次所得的足迹前后＜10 cm均不纳入统计。若测试过程中小鼠突然停止或后退，则当次测试作废需重新测试。

2.加速转棒实验：受测小鼠放于加速转棒实验仪上，以4 r/min的初始转速转动10 s之后，转棒在4 min内从4 r/min的转速加速到40 r/min，并维持1 min的时间。记录每只受测小鼠在5 min内于转棒仪上停留的时间以及掉下转棒时的转速，每只小鼠均进行3次实验。

3.梯踏步实验：小鼠被放于梯踏步实验仪内，分别用规律性的梯踏步以及不规律的梯踏步方式进行测试，规律性的梯踏步以1 cm的梯间距规律排列，而不规律的梯踏步通过1～2 cm间距不规律排列的梯增加受测小鼠的难度进行测试。每只受测小鼠在进行3次正式测试之前均进行3次预实验。通过记录软件自动记录每只受测小鼠通过所有梯的过程中脚步滑落的次数以及通过时间。

四、标本制备

小鼠麻醉后心脏灌注磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），置换出全身血液后用4%的多聚甲醛灌注固定。完整取出小鼠脑组织并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定24 h，后顺次用蔗糖溶液（10%、20%、30%）进行梯度脱水。分离小脑组织，以25 μm的厚度进行冰冻切片，并收集于载玻片上。

五、H&E染色

将干燥后的冰冻切片，放入PBS溶液中清洗10 min×3次，洗去包被液，然后置于苏木精水溶液中染色1 min后立即放入PBS溶液中清洗5 min，随后将切片放入1%的盐酸溶液中褪色10 s后再次用PBS清洗5 min。切片经50%、70%、80%的乙醇溶液依次脱水5 min后放入0.5%的伊红溶液中染色1 min。经PBS清洗5 min后依次经95%的乙醇和无水乙醇脱水3 min，并经二甲苯透明后用中性树脂封存，后置于显微镜下拍摄获取图像，以分析TLR4缺失后的小脑组织解剖结构的变化。

六、定量分析

分别选取4对同窝对照的野生型和TLR4-/-小鼠进行小脑面积和分子层（molecular layer，ML）厚度的分析。

小脑面积的计算：每只小鼠选取6张近中线的小脑组织H&E染色切片，通过Image J软件测量每张切片上的小脑组织面积并平均。

ML厚度测定：每只小鼠选取6张近中线的小脑组织H&E染色切片，通过Image J软件测量每张切片上的小脑VII叶的ML厚度（定义：ML表面到PCL的垂直距离）并平均。

七、统计学分析

采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，数据以均数±标准误（±sx）的形式呈现，采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、TLR4缺失减弱了小鼠的运动平衡能力

足迹实验结果显示 TLR4-/-小鼠在步长 （t=1.068，P=0.299）和步宽（t=-0.775，P=0.448）以及肢体间协调（t=-0.358，P=0.724）等方面与野生型小鼠比较差异均没有统计学意义，TLR4缺失并未明显影响小鼠的步态（表1）。

加速转棒实验发现TLR4-/-小鼠在转棒上的表现优于野生型小鼠，其表现出比野生型小鼠更长的停留时间（t=-2.303，P=0.033）和更高的落下时的转数（t=-2.310，P=0.032），但值得注意的是，TLR4-/-小鼠倾向于弯腰以腹部紧贴转棒并且比野生型小鼠有着更快的步频（表1）。

梯踏步实验结果显示在规律性的梯踏步实验中TLR4-/-小鼠和野生型小鼠在脚步下滑次数上并没有明显的差异，但在通过时间上TLR4-/-小鼠明显长于野生型小鼠（t=-1.507，P=0.148）。而不规律的梯踏步实验结果显示TLR4-/-小鼠在脚步下滑次数 （t=-2.723，P=0.013）和通过时间（t=-1.661，P=0.113）上均明显的多于野生型小鼠（表1）。

二、TLR4缺失导致小鼠小脑ML厚度减少

H&E染色结果显示TLR4-/-小鼠的小脑组织在解剖学上的组织结构和分层上与野生型小鼠并没有明显的差别（图1）。进一步统计分析H&E染色切片上的小脑切面面积，同样显示2组小鼠差异没有统计学意义（t=1.292，P=0.244）。分析ML厚度的结果显示TLR4-/-小鼠的小脑ML厚度较野生型小鼠明显减少（t=2.593，P=0.041），但颗粒细胞层的面积却没有明显的差异（t=1.244，P=0.260）（表 2）。

讨 论

前期研究证实，TLR4基因的缺失可以增加小鼠海马区神经前体细胞的增殖以及神经元的分化，并能增强海马依赖的学习和记忆[4]。前期研究数据揭示TLR4高表达于小脑PC，而小脑对于运动平衡的执行至关重要[8]。因此本研究进一步阐述了TLR4基因在调节海马依赖的学习记忆之外还能够参与运动平衡的调节。

表1 2组小鼠的运动平衡能力实验结果（±sx）

表1 2组小鼠的运动平衡能力实验结果（±sx）

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表2 2组小鼠的小脑形态学分析结果（±sx）

表2 2组小鼠的小脑形态学分析结果（±sx）

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图1 TLR4-/-小鼠与野生型对照小鼠小脑切片H&E染色结果

TLR4-/-小鼠展示了异常的运动平衡能力。足迹实验中步长、步宽以及肢体间协调与野生型小鼠并没有差距，这可能归因于TLR4-/-小鼠用更快的运动速度作为代偿，弥补了运动时的步态差异[9]。同时这样一种代偿机制也使得TLR4-/-小鼠在加速转棒实验中的表现优于野生型小鼠，这与先前Okun等[9]所观察到的结果一致。然而，值得注意的是在加速转棒实验中的TLR4-/-小鼠表现出弯腰曲背以其腹部紧贴转棒的姿态，这很有可能是TLR4-/-小鼠为了降低身体重心，增加步频从而防止跌落的代偿动作。TLR4曾被报道与抑郁性疾病密切相关，这与应激状态下诱导的下丘脑-垂体-性腺轴的激活有关，而这条信号轴的激活也与TLR4密切相关，当TLR4缺失的时候，小鼠在加速转棒实验条件下其实是处于一种应激的状态，因而表现出更快的步频[10-13]。同样在梯踏步实验中观察到，在非应激状态下TLR4-/-小鼠能够通过调整其步态顺利地通过规律排列的踏步梯而避免下滑，但当踏步梯不再规律性排列的时候，TLR4-/-小鼠便展示出较野生型小鼠更差的表现，这也说明TLR4-/-小鼠的这种代偿机制是有限的。

PC发出树突伸向小脑ML，通过树突棘与ML中走行的平行纤维（parallel fibers，PFs）和攀缘纤维（climbing fibers，CFs）形成突触连接，从而接收信号的输入[1]。本实验观察到TLR4-/-小鼠的ML厚度有所减少，因此推测在运动平衡功能执行过程中其接收到的来自于PFs、CFs传入的信息较野生型小鼠是更少的，从而导致小鼠的运动功能出现障碍。前期研究也曾报道小脑ML厚度的减少与PC的死亡有关[14,15]。

综上所述，本研究通过运动平衡相关的行为学测试，揭示了TLR4基因的缺失可导致小鼠运动平衡受损。今后将进一步分析TLR4缺失对于PC的影响以及其具体的作用机制，进一步明确TLR4-/-小鼠出现运动平衡功能障碍的原因，也有助于揭示TLR4在PC生长、发育以及维持中的作用和机制。