切取活检对兔VX 2舌癌移植瘤生长及转移的影响及其机制研究

叶丽君，周新春，殷小佳，尚裕，魏巍，赵青

湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院1肿瘤科，2病理科，3口腔科，湖北 襄阳441000

舌癌（carcinoma of tongue）是临床中常见的口腔恶性肿瘤，具有恶性程度高、早期颈部转移的特点。现阶段舌癌的发病率逐年升高，而病理诊断是确诊该病的金标准[1]。临床工作中，对于疑似病例往往先进行切取活检，确诊后再行择期手术。但有研究指出，切取活检会促进多种鳞癌细胞的增殖和转移，但具体机制仍不清楚[2]。本研究通过构建大白兔VX2舌癌移植瘤模型，观察切取活检对肿瘤生长及转移的影响，并初步探讨其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

VX2鳞状细胞癌瘤株由北京协和医院病理科获得，新西兰大白兔购自武汉大学生命科学院动物实验中心，戊巴比妥钠（粉剂）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，抗核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司，SP免疫组化检测试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 制作荷瘤兔

取生长良好的肿瘤细胞，台盼蓝染色进行活细胞计数，调至1×108/ml活细胞密度；兔术前禁食12 h，采用3%戊巴比妥耳缘静脉注射进行全麻，仰卧位固定于兔台，取兔后腿内侧部位脱毛后注入1 ml肿瘤细胞悬液，4周左右在接种部位能触及直径3～4 cm的实性包块，即为荷瘤兔。

1.3 兔VX 2移植瘤模型的构建及切取活检处理

切取荷瘤兔的肿瘤组织，去除肌肉组织及中心处的坏死组织，使用含双抗的Hank’s液冲洗2遍后使用锋利的眼科剪剪碎，使用0.25%胰酶消化液制备肿瘤细胞悬液，200目细胞筛过滤，制备细胞密度为5×108/ml的肿瘤细胞悬液。取48只雄性新西兰大白兔，体重2.7～3.3 kg，全麻后固定于兔台，使用5号皮试细针头在舌侧缘中1/3处舌黏膜下注入0.1 ml肿瘤细胞悬液，3周后将舌部成瘤兔（共45只）按体重由小到大进行编号（1～45），采用随机数字表法将其分为实验组23只及对照组22只。实验组全麻后切取肿瘤组织4 mm×4 mm×4 mm，4%多聚甲醛保存，对照组只进行全麻处理。

1.4 取材及病理学观察

术后第1、3、7、14、21天无痛处死兔子（前4次各组均取4只，最后1次全部处死），记录每只兔子体重，切取完整舌部肿瘤及双侧颌下淋巴结，测量大小后将组织置于10%多聚甲醛中固定。将淋巴结标本切片于苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色后观察是否有转移。

1.5 原发灶生长情况大体观察

在第1、3、7、14、21天观察并记录兔子舌部肿瘤的大小。将兔子舌体牵出，游标卡尺测量肿瘤的长、宽、高，并计算肿瘤体积[3]。设定活检前肿瘤体积（V1）、活检取下肿瘤的体积（V2）、处死后取下肿瘤的体积（V3）。实验组的肿瘤体积变化：V实验=V3+V2-V1，对照组的肿瘤体积变化：V对照=V3-V1。

1.6 免疫组化染色检测蛋白表达情况

采用免疫组化（SP）法检测舌部肿瘤NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表达情况。NF-κB、MMP-9、VEGF的抗体浓度均为1∶150，二氨基联苯胺（3，3N-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染后封片观察，行半定量分析。细胞质着色细胞为阳性细胞，按着色强度及阳性细胞所占比例评价表达情况。①按着色强度：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分。②按阳性细胞所占比例：每个标本选6个高倍视野，计数每个视野下的细胞数及阳性细胞数，计算阳性细胞所占比例，＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。将两项结果相加，≥1分为阳性表达，≥4分为高表达，＞5分为过表达。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计-软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料以频数表示，组间比较采用Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔VX 2舌癌移植瘤切取活检动物模型的建立

经舌部注射肿瘤细胞3周后，48只新西兰大白兔有45只（93.75%）舌部成瘤。实验组于术后第15、20天各死亡1只，对照组于术后第19天死亡1只，死亡动物取材，并计入临近时间点。

2.2 术后原发灶生长情况的比较

兔子注射肿瘤细胞后第1周未能观察到明显变化，第2周能看到舌部有小包块形成，质韧，第3周瘤体迅速增长，体积明显变大。实验组行切取活检术，术后第1周肿瘤原发灶与对照组比较，未见明显异常，术后第2周可见实验组肿瘤原发灶体积增长明显快于对照组，术后第3周实验组肿瘤影响兔子进食，消瘦明显。术后第3、7天，两组肿瘤原发灶体积变化比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；术后第14天及第21天，实验组肿瘤原发灶体积变化均明显大于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 肿瘤原发灶切取活检术后对照组与实验组肿瘤原发灶体积变化的比较（mm 3，±s）

表1 肿瘤原发灶切取活检术后对照组与实验组肿瘤原发灶体积变化的比较（mm 3，±s）

组别实验组对照组t值P值2 1.8±8.9 1 9.2±7.7 0.4 4 2 0.7 2 4 1 0 2.4±1 1.6 8 8.7±1 1.3 1.1 7 0 0.1 3 2 1 6 3.2±1 2.5 1 2 1.0±1 1.2 5.2 6 0 0.0 0 1 2 0 4.0±1 7.3 1 5 2.0±1 0.3 5.3 4 9 0.0 0 1第3天（n实=4，n对=4）第7天（n实=4，n对=4）第1 4天（n实=5，n对=4）第2 1天（n实=6，n对=6）

2.3 HE染色观察

对取下的颌下淋巴结进行HE染色，显微镜下观察肿瘤转移情况，可见实验组（共46个淋巴结）有7个淋巴结能见到肿瘤转移，而对照组（共44个淋巴结）有2个淋巴结能见到肿瘤转移，经Fisher确切概率法比较，差异无统计学意义（P=0.182）。

2.4 免疫组化染色观察

对原发灶进行免疫组化染色观察，结果显示，实验组NF-κB、MMP-9、VEGF的阳性表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表 2）

表2 两组舌部肿瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表达水平的比较（±s）

表2 两组舌部肿瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表达水平的比较（±s）

组别实验组（n=23）对照组（n=22）t值P值NF-κB 4.2±1.1 1.9±0.9 7.657 0.000 MMP-9 4.4±1.3 1.8±1.0 7.495 0.000 VEGF 3.4±0.9 1.9±1.2 4.758 0.000

3 讨论

病变组织切取活检被认为是肿瘤诊断的金标准。在临床工作中，往往需要对异常组织进行术前病理活检来确定是否进行手术治疗以及手术切除的范围。但有研究显示，切取活检会加速肿瘤的发展及转移[4]；也有研究认为切取活检短期内对病变部位无不良影响[5]。切取活检对肿瘤的生长及转移有何影响，其具体的分子机制仍不清楚。

本实验采取改良肿瘤细胞悬液注入法构建大白兔舌癌动物模型[6-7]，实验中成瘤率达93.75%。与化学诱导法相比，本方法成瘤时间短，在第2周即可见到注入部位有瘤体形成；注入部位及注入的肿瘤细胞数目可控，使形成的肿瘤组织的部位、所需时间、肿瘤大小较接近，有利于后期的实验研究。

本研究结果显示，实验组肿瘤生长速度明显快于对照组，表明切取活检会加速肿瘤原发灶的生长。尽管实验组的淋巴结转移数高于对照组，但两组比较，差异无统计学意义。但刘济远等[8]认为切取活检会加速肿瘤原发灶的增长和淋巴结转移，与本实验的结果不完全一致，这可能是由于实验选取的动物不一致，所观察的肿瘤不同所导致的。

NF-κB是机体中一个重要的炎性信号因子，在肿瘤中也伴有多条炎症信号通路的激活[9]。VEGF参与了血管的生成过程，与肿瘤中微循环的形成有关并能促进肿瘤的转移[10]。MMP能降解细胞外基质的蛋白成分，破坏细胞间的连接，促进肿瘤的侵袭与转移[11]。本研究发现，实验组舌部肿瘤中的NF-κB、VEGF、MMP-9的阳性表达水平均明显高于对照组，提示切取活检可能通过促进NF-κB、VEGF、MMP-9的表达来促进肿瘤增长。据此推测切取活检部位可能会出现炎性反应，使NF-κB的表达升高，从而上调VEGF的表达促进肿瘤内血管的形成，使肿瘤的增长加快；同时使MMP-9的表达升高，破坏了细胞间的连接，使肿瘤细胞能浸润到周围正常组织内，使肿瘤面积增大。有研究显示，切取活检的结果使患者的心理压力增加，长期的心理焦虑会影响体内的多种激素分泌[12]，干扰了机体的免疫防御机制，从而促进了肿瘤的生长和转移。

综上所述，切取活检能够促进肿瘤的生长，但在临床工作中常先进行活检再择期手术。因此，寻找一种能替代病理活检的新诊断方式或减轻切取活检对肿瘤的影响将是以后的研究方向。