利用TCGA数据集分析PPFIA 3在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义△

王玲玉，潘跃银

中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）肿瘤化疗科，合肥 230001

乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤之一，中国女性乳腺癌的发病率和病死率在全球中均处于较低水平，但是发病人数占全球的11.19%，居世界第2位，且近20年发病率与病死率均增长迅速，防控形势严峻。根据乳腺癌的免疫组织化学分子特征，将其分为Luminal A型[雌激素受体（estrogen receptor，ER）+/孕激素受体（progesterone receptor，PR）+、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）-、Ki-67＜14%）]、Luminal B型（ER+/PR+、HER2-、Ki-67≥14%）、HER2过表达型（ER-、PR-、HER2+）、三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）（ER-、PR-、HER2-）4种类型[1-2]。其中，TNBC是乳腺癌中较特别的一类，与激素受体阳性和HER2阳性乳腺癌相比，缺乏内分泌治疗和抗HER2治疗，因此目前其治疗方式仍以手术和传统放化疗为主，并且预后较差[3-4]。因此，探索TNBC发生发展的分子机制并寻找有效的分子靶点以改善患者的预后成为亟待解决的临床问题。PPFIA3又称 liprin α3，属于 liprin 家族和 liprin α亚家族。liprin α蛋白是一种与受体蛋白酪氨酸磷酸酶、白细胞共同抗原相关蛋白和其他突触蛋白相互作用以促进突触伴侣选择和活性区组装的适配器[5]。传统观点认为PPFIA3主要与中枢神经系统以及顶体反应等生物学过程相关，但近年来有研究表明PPFIA3与恶性肿瘤的发生发展相关[6]。然而，PPFIA3与TNBC的关系目前尚不明确。因此，本研究通过利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）基因组学与临床特征数据，初步探讨PPFIA3在TNBC中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 数据资料收集

从TCGA数据库（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下载TNBC患者的基因表达数据和临床特征数据，入组病例是1996—2013年经病理学检查确诊的157例乳腺癌患者，均为女性，年龄29～90岁；病理类型：浸润性导管癌140例，髓样癌8例，特殊型癌9例；临床分期为IA～Ⅳ期；左侧乳腺癌85例，右侧乳腺癌72例。患者的随访时间为10年。PPFIA3基因表达水平以Log2[每百万片段中来自于某基因每千碱基长度的片段数（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，FPKM）+1]计算。临床特征信息还包括肿瘤组织与癌旁正常组织、病理T分期、淋巴结转移情况以及患者的生存情况。

1.2 PPFIA 3共表达网络

通过CytoScape软件中的Cluego插件利用KEGG数据库对共表达基因进行信号通路富集，P＜0.05的基因集作为显著富集的基因集。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PPFIA 3的共表达网络

分析PPFIA3与19 700个mRNA表达的相关性，相关性分析结果显示874个基因与PPFIA3具有共表达的关系。对这些共表达基因进行KEGG信号通路富集分析，结果显示这些基因主要涉及硫中继系统、萜类骨架生物合成、过氧化物酶体、Hippo信号通路、甲状腺癌等通路或肿瘤、细胞成分的信号转导（表1、图1）。

2.2 不同临床特征的TNBC患者PPFIA 3表达水平的比较

从TCGA数据库中共获取TNBC患者157例，将其临床特征以R语言处理，应用t检验分析PPFIA3在不同组织、T分期以及是否有淋巴结转移患者中的表达差异。结果显示，肿瘤组织中的PPFIA3表达水平为（1.229±0.576），明显高于癌旁正常组织的（0.728±0.254），差异有统计学意义（t=-5.956，P＜0.01）。T3～4期、淋巴结转移患者的 PPFIA3表达水平均高于T1～2期、淋巴结未转移患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表1 PPFIA3共表达基因集和通路

图1 PPFIA3共表达基因集和通路比例图

表2 不同临床特征的TNBC患者PPFIA3表达水平的比较

2.3 PPFIA 3高表达与低表达的TNBC患者生存时间的比较

在TCGA数据库中，PPFIA3高表达的患者79例，低表达的患者78例，PPFIA3高表达的患者中位生存期明显短于PPFIA3低表达患者（2965 dvs3472 d，P=0.009，HR=2.756，95%CI=1.51～5.40）。（图2）

图2 PPFIA3高表达（ n=79）与低表达（ n=78）的TNBC患者的生存曲线

3 讨论

乳腺癌是人类肿瘤中最异质的肿瘤之一，其中，TNBC每种亚型仍表现出较大的个体差异，要想探索TNBC的生物学行为和治疗反应，就需要确定单个肿瘤基因谱[6]。多项研究表明，PPFIA3甲基化水平在肿瘤组织中高于癌旁正常组织，在肿瘤患者血清DNA中高于健康人群，以其高灵敏度和高特异度有望成为肿瘤简单、无创的检测方法[7-8]。夏菁等[9]发现关于BRMS1及其甲基化与TNBC发生发展相关的重要信息，其去甲基化后高表达可抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。但目前针对PPFIA3与TNBC的增殖、转移和预后的研究罕有报道。

PPFIA在ER+和ER-乳腺癌组织中存在差异性表达，可能受雌激素调节[10-11]，提示PPFIA在特定分型的乳腺癌中具有独特的意义。PPFIA3通过α螺旋区先与mDia1、RhoA形成三元配合物，抵消RhoA对mDia1的激活，下调mDia1的功能，形成丝状肌动蛋白，参与肿瘤细胞的能动性和侵袭转移的过程[12]。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞间细胞黏附分子减少，细胞骨架蛋白重排，运动能力增强，渗入内皮血管进入体循环，定植于远端位点即形成转移灶[13]。Zohrap等[14]发现MAPK信号通路下调可以抑制MDA-MB-231、MCF12A等TNBC细胞株增殖和存活。Khan等[15]发现同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）可抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K），降低下游效应因子MTOR的活性，PTEN缺失可通过激活MTOR促进TNBC细胞增殖，MTOR抑制剂的靶向治疗可能有助于肿瘤的治疗。本研究利用TCGA数据库，发现PPFIA3表达水平在TNBC肿瘤组织中明显高于癌旁正常组织，在 T3～4期患者中高于 T1～2期患者，在淋巴结转移患者中高于淋巴结未转移患者，即分期越晚的患者PPFIA3表达水平越高。更为重要的是，PPFIA3的表达与生存预后有关，PPFIA3高表达患者的生存时间明显短于低表达的患者。以上结果提示，PPFIA3高表达可能是TNBC患者不良的预后因素。另外，本研究通过KEGG发现PPFIA3可能通过TNF、MAPK、MTOR等信号通路参与TNBC细胞的增殖、转移等过程，影响患者的预后。

TCGA数据库提供的mRNA水平的数据，不能完全代表该基因表达蛋白质水平的意义，今后的研究可以结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、免疫组织化学等方法和前瞻性、回顾性分析验证PPFIA3的mRNA和蛋白质在TNBC中的临床意义，为今后TNBC的基因组分类和靶向治疗研究提供新线索。

综上所述，PPFIA3可能通过 TNF、MAPK、MTOR等信号通路参与TNBC细胞的增殖、转移等过程，在TNBC中，PPFIA3高表达提示预后不良，其可能作为预测TNBC患者预后的有效生物标志物。