HPLC法测定葡萄酒中胭脂红含量的不确定度分析

金桂花 刘 汇 张 琳

（延边州食品药品检验所，吉林 延吉 133000）

胭脂红（英文名：PONCEAU 4R），化学式：C20H11N2Na2O10S3，又名食用赤色102号（日本）、使用红色7号、丽春红4R、大红、亮猩红，为水溶液偶氮类着色剂。胭脂红是目前我国使用最广泛、用量最大的一种单偶氮类人工合成色素。因近年来，有报道指出，胭脂红与欧盟标准禁用的苏丹红I 同属于偶氮类色素，偶氮化合物在体内可代谢生成致突变原前体－－芳香胺类化合物。我国规定的适用范围和使用量均和苋菜红相同。测量不确定度，可以检测、校准、评估数据，它是一种能够合理赋予测量对象的分析性，建立测量对象分析因素与因素之间关联性的分析方法[1-2]，这种方法的应用机制为测量不确定度评定能给出测量结果的置信度和置信区间，不仅对于测量结果的评价具有重要作用，还可以通过对每个不确定度分量大小的分析，明确检测过程中影响不确定度因素的主次。将HPLC法应用在葡萄酒的胭脂红检测中的原因，是因为胭脂红与其他合成色素着着关联性，如它能调配出类似于紫葡萄色或其他偶氮类合成着色剂，通过分析色谱，了解色谱检测结果的关联性，可以分析出葡萄酒中是否含有胭脂红合成色素[3]。本文对高效液相色谱法测定葡萄酒中胭脂红含量的测量不确定度进行评定，通过实验的方法找出该方法中影响测量结果不确定度的主要因素，说明因素之间的主要观联与关联结果反映出的检测结果分析。

1 实验部分

1.1 仪器。BT125D型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LDZ5-2型离心机：北京医用离心机厂；Waters-e2695型高效液相色谱仪：美国沃特斯公司。

1.2 试剂。胭脂红标准溶液：0.5 mg/mL，批号：12001，购于中国计量科学研究院；甲醇色谱醇；乙酸铵分析纯；水均为去离子水。

1.3 HPLC实验条件及系统适用性。色谱柱：依利特C18（4.6 mm×250 mm、10 μm）；检测器：紫外检测器；波长：254 nm；柱温：28 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：甲醇-乙酸铵溶液（0.02 mol/L，pH=4）梯度洗脱。见表1。

表1 HPLC实验条件及系统适用性

1.4 测定方法。标准溶液的制备：精密吸取胭脂红标准溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成每1 mL含胭脂红10 μg/mL的溶液。

供试品溶液的制备：精密吸取混合均匀的供试品5 mL，置离心管中，称定重量，于2500转/分钟，离心5 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

测定：分别精密吸取标准溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外表峰面积法定量。

2 结 果

2.1 不确定度数学模型

P：样品中胭脂红的含量（mg/kg）；Cs：胭脂红标准品浓度0.5 mg/mL；Ax：供试品峰面积；As：标准品峰面积；Wx：供试品质量 g；Vx进、Vs进：供试品与标准品进样量 μL。

2.2 不确定度来源分析及分量计算

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 取样（样品的均匀性）：样品均匀，忽略不计。

2.1.2 称重过程。BT125D型电子天平：感量为万分之一，a=±0.1 mg；天平校准：U1（m样/对）= a／k=0.05774 mg（服从矩形分布；天平重复：U2（m样／对）=0.05 mg （公式：0.5×最后一位有效数字，万分之一天平：0.1 mg）；天平引起的合成不确定天平引起相对不确定度：Urel

2.1.3 吸取过程：5 mL移液管引入的不确定度：容量允差，服从矩形分布：K＝√3 ：u1（V5）=a/K＝0.00866 mL；温度引起的不确定度：u2（V5）=a/K ＝0.00306 mL；合成不确定度：U（V5）=相对不确定度：U rel×100%＝0.187%；供试品溶液制备过程引入的不确定度：u rel （P样）=0.187%

2.2 标准品溶液配制

2.2.1 标准品的纯度：说明书未提供不确定度，在此不参加计算。

2.2.2 溶解稀释过程：1 mL移液管引入：合成不确定度：U（VX）相对不确定度：U rel （V1）容量瓶引入：合成不确定度：相对不确定度：Urel因此标准品溶液配制过程引入的不确定度：u rel （P对）= = 0.417%。

2.3 供试品和标准溶液峰面积引入的不确定度：U rel （A样）= U rel（A对）= 0.577%。

2.4 液相色谱仪引入的不确定度：U（仪）= 0.0404%。

2.5 结果的重复测定：测量结果相对不确定度：u rel （P平均）=0.340%；合成相对不确定度：u rel （P）=0.996%；合成标准不确定度：u （P）=P平均×u rel （P）=10.5×0.996% = 0.105 mg/kg；扩展不确定度：U=k u （P）=2×0.105 =0.21≈0.2 mg/kg （k=2）；报告结果：供试品中胭脂红的含量： P=（10.5±0.2）mg/kg （k=2）。

3 探 讨

当前国家规定不允许在葡萄酒中添加胭脂红合成色素，为了了解葡萄酒质量是否达到国家制订的标准，进行胭脂红不确定分析有非常重要的意义。HPLC法是一种提取方法软件简便、检测时受到干扰的因素少、检测成本投入不高的技术方法。对HPLC法测定葡萄酒中胭脂红含量的不确定度分析技术进行分析。HPLC法测定的内容包括应用不确定度分析分量的来源、分量对结果影响的程度、不确定度对检测方法的影响、对其他拓展因素的影响这项项内容。通过分项这四项结果，可以了解葡萄酒中胭脂红的含量。评估脂胭红含量的参数为置信概念、不确定度这两项，而不确定度包含标准溶液浓度、标准曲线线性拟和、重复测定、样品制备这四项，它们对不确定度的贡献为依次为降序排列。影响结果的主要因素重复测定因素，在99.6%的置信概率下得到其扩展不确定度为0.2 mg/ kg。