我国生鲜乳中黄曲霉毒素M1污染风险分析

李松励 闵 力 高亚男 郑 楠 张养东 王加启*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙410128；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)，北京100193；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；4.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，广州510640)

据联合国粮农组织(food and agriculture organisation，FAO)估计，全球约25%的粮食作物被霉菌毒素污染，已严重威胁食品质量安全[1]。2011年，我国牛奶中黄曲霉毒素M1(AFM1)超标事件引起了政府、学者和消费者对牛奶中霉菌毒素污染的关注。AFM1是牛奶质量安全风险评估锁定的主要危害因子，对人体产生免疫毒性、肾毒性、肝毒性等生物危害，可能导致人致畸、致癌、诱发突变等[2]。国际上，亚洲、美洲、非洲等国家都相继报道了奶及奶产品中的AFM1污染现象。研究者检测了巴基斯坦某地区水牛奶和牛奶中AFM1含量，检出率分别为34.5%和37.5%[3]。2007年Alonso等[4]对从阿根廷境内采集的生鲜

牛乳样品进行了检测，结果表明，有11%的样品AFM1浓度超出了欧盟限量标准(50 ng/L)，浓度范围为10.0～70.0 ng/L。2008年Motawee等[5]对埃及境内不同物种的奶样进行了检测，结果表明，50%的水牛奶和30%的牛奶样品中AFM1浓度超出了欧盟限量标准(50 ng/L)。

我国生鲜乳中AFM1风险评估监测是一项长期的工作，对其结果的分析研究有助于了解和把握我国奶制品的质量安全现状。本试验采集了我国奶业主产区的生鲜乳样品共计5 080份，对其AFM1浓度进行检测，旨在系统地评估我国生鲜乳中AFM1风险情况，为提升我国奶业质量安全提供信息。

1 材料与方法

1.1 样品信息

2016年春季(4月份)、夏季(8月份)、秋季(10月份)和冬季(2月份)从河北省、河南省、黑龙江省、山东省和内蒙古自治区5个主产区(奶牛存栏量>50万头奶牛)共采集生鲜乳样品5080份，其分布情况如表1所示。所有生鲜乳样品均是从这些地区奶站的奶罐车中收集。为了确保收集到的生鲜乳样品具有代表性，本试验采用了随机抽样方式[6]，结合河北省、河南省、黑龙江省、山东省和内蒙古自治区5个主产区的奶牛养殖分布、生鲜乳生产情况制订采样方案，保障样品均匀覆盖各区域。

表1 我国奶业主产区2016年采集的4个季度生鲜乳样品的分布情况

1.2 样品前处理

采集的生鲜乳样品在4 ℃进行保存，所有样品均在保质期内(5 d内)完成AFM1浓度的检测。样品测定前在4 ℃的环境中进行3 000 r/min离心10 min，去除乳脂，取上清液进行测定。

1.3 生鲜乳中AFM1浓度的检测

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法对生鲜乳中的AFM1浓度进行检测。本试验中采用的试剂盒(RIDASCREEN Aflatoxin M1 Test Kit, R-Biopharm AG,德国)的检出限(LOD)为5 ng/L，其中的标准品浓度分别为0、5、10、20、40和80 ng/L，检测步骤按照试剂盒的说明书进行。

当样品中AFM1浓度低于检出限(5 ng/L)时判定为未检出；当样品中AFM1浓度高于试剂盒中标准品的最高浓度80 ng/L时，对样品进行稀释后再次测定。对试剂盒的相关参数进行验证分析，包含：检出限=5 ng/L、定量限(LOQ)=8.5 ng/L、回收率=86%～121%、相对标准偏差(RSDr)<10%，确保试验的准确性。

1.4 统计分析

所有生鲜乳样品均进行2次AFM1浓度测定，以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 19.0的Mann-Whitney U非参数检验进行统计分析。

2 结果与分析

表2显示了2016年我国奶业主产区(河北省、河南省、黑龙江省、山东省和内蒙古自治区)AFM1污染情况。在河北省，仅有4个样品(0.40%)检测出AFM1，低于欧盟(50 ng/L)和我国(500 ng/L)的限量标准。在黑龙江省未发现有AFM1污染的生鲜乳，内蒙古自治区和山东省分别有3个(0.28%)和7个(0.67%)样品检测出AFM1，而在河南省的生鲜乳样品中AFM1污染情况较常见(n=220)，污染发生率为27.5%。本试验所采集的5 080份生鲜乳样品中，有234个样品检测出AFM1，污染发生率为4.6%。2016年，我国奶业主产区生鲜乳样品中AFM1的检出率按照由低至高的顺序依次为黑龙江省(0)、内蒙古自治区(0.28%)、河北省(0.40%)、山东省(0.67%)和河南省(27.5%)。

所有的生鲜乳样品中，AFM1浓度最高值为273 ng/L，来源于河南省。所有生鲜乳样品的AFM1浓度均未超过我国的限量标准(500 ng/L)；而河南省有34个样品、山东省有2个样品的AFM1浓度超过了欧盟的限量标准(50 ng/L)，此36个生鲜乳样品(0.7%)不适合作为出口的奶及奶制品。其他省份的生鲜乳样品AFM1浓度均低于欧盟的限量标准(50 ng/L)。

表2 2016年我国奶业主产区生鲜乳样品中AFM1污染的发生率和分布情况

1)当样品中AFM1浓度低于试剂盒检出限(5 ng/L)时，判定为未检出。A sample was considered not to be detected when its AFM1concentration did not exceed the quantification limit of 5 ng/L, which was the detection limit of the test kit.

2)当样品中AFM1浓度在5～50 ng/L时，未超出欧盟的限量标准。A sample was considered to be below the EU limit standard when its AFM1concentration was 5 to 50 ng/L.

3)当样品中AFM1浓度在50～500 ng/L时，高于欧盟的限量标准但低于中国的限量标准。A sample was considered to be above the EU limit standard but below the Chinese limit standard when its AFM1concentration was 50 to 500 ng/L.

4)当样品中AFM1浓度高于500 ng/L时，超出了中国的限量标准。A sample was considered to be above the Chinese limit standard when its AFM1concentration exceeded 500 ng/L.

试验进一步对4个季度生鲜乳的AFM1污染情况进行了分析。结果表明：在我国奶业主产区(黑龙江省、内蒙古自治区、河北省、山东省和河南省)，冬季的生鲜乳中AFM1污染发生率最高(11.2%)，其次是秋季(4.5%)、夏季(2.5%)和春季(1.5%)；冬季占4个季度AFM1污染样品的49.6%(图1)。

3 讨 论

2010年，本课题组的郑楠等[7]和韩荣伟等[8]分别开展了不同地区360份生鲜乳样品和200份生鲜乳样品中AFM1污染情况的研究，结果显示AFM1检出率分别为78.1%和32.5%，所有样品均未超出中国和美国的限量标准(500 ng/L)。此外，本课题组还跟踪分析了2013—2015年中国南部、北部、东北和西部生鲜乳中AFM1的污染情况[9]。该试验从中国南部(重庆市、福建省、广东省、江苏省、上海市、四川省)、北部(北京市、天津市、河北省、山东省)、东北(黑龙江省、内蒙古自治区)和西部(甘肃省、陕西省、新疆维吾尔自治区)共采集了1 550份生鲜乳样品，采用高效液相色谱法(检出限为10 ng/L)检测样品中的AFM1浓度(表3)。在2013年的366个样品中，AFM1污染发生率为21.0%，其浓度范围是10～240 ng/L，其中有11.7%的样品超出了欧盟的限量标准(50 ng/L)。在2014年的624个样品中，AFM1污染发生率为28.5%，其浓度范围是10～250 ng/L，其中有7.7%的样品超出了欧盟的限量标准(50 ng/L)。在2015年的560个样品中，AFM1污染发生率为14.1%，其浓度范围是10～144 ng/L，其中有1.8%的样品超出了欧盟的限量标准(50 ng/L)。2013—2015年的生鲜乳样品AFM1浓度均未超出中国和美国的限量标准(500 ng/L)，且呈现AFM1浓度逐年降低的规律。针对不同区域的分析显示：我国南部区域生鲜乳中AFM1污染的问题更为突出，2013—2015年中超出欧盟限量标准的比例分别为32.5%、10.8%和4.0%，均高于其他区域；2013—2015年我国东北区域的生鲜乳样品未发现有AFM1污染的情况。

图1 2016年我国奶业主产区生鲜乳样品

年份Year区域Location检出样品数/样品总数(发生率)No. of positive samples/No. of total samples (incidence)平均值±标准差Mean±SD/(ng/L)浓度范围Concentration range/(ng/L)超出欧盟限量标准的样品数(超出率) No. of samples above the EU limit standard (excess rate)2013南部 South53/120 (44.2%)82±49a 10～24039 (32.5%)北部 North18/141 (12.8%)43±49a 10～1874 (2.8%)东北 Northeast0/105 (0) <10b<100 汇总 Total77/366 (21.0%)69±52A 10～24043 (11.7%)2014南部 South62/240 (25.8%)56±51a’10～22226 (10.8%)北部 North92/160 (57.5%)31±25a’10～12816 (8.9%)东北 Northeast0/80 (0) <10b’<100 西部 West22/144 (15.3%)47±29a’182～2507 (4.9%)汇总 Total178/624 (28.5%) 42±39B 10～25048 (7.7%)2015南部 South42/200 (21.0%)31±22a”10～978 (4.0%)北部 North23/160 (14.4%)24±27a”10～9643 (1.9%)东北 Northeast0/80 (0) <10b”<100 西部 West14/120 (11.7%)26±35a”10～1441 (0.8%)汇总 Total79/560 (14.1%)26±24C10～14410 (1.8%)

样品中AFM1浓度高于10 ng/L为检出样品。数据标注不同小写字母(2013年：a和b；2014年：a’和b’；2015年：a”和b”)表示不同区域的AFM1浓度存在显著差异(P<0.05)；数据标注不同大小字母(A、B和C)表示2013、2014和2015年汇总的样品间存在显著差异(P<0.05)。

Positive samples mean the AFM1concentration in the samples exceeding 10 ng/L. Values of AFM1concentration with different small letter (2013: a and b; 2014: a’ and b’; 2015: a” and b”) superscripts mean significant difference among different regions (P<0.05); values of AFM1concentration with different capital letter superscripts mean significant difference among total samples in 2013, 2014 and 2015 (P<0.05).

为了进一步分析当今我国生鲜乳中AFM1污染情况，本试验选取我国奶业主产区(河北省、黑龙江省、河南省、内蒙古自治区和山东省)奶牛数量大于50万头的牧场，采集了4个季度的共5 080份生鲜乳样品，通过检测分析2016年度中国奶业主产区生鲜乳中AFM1的污染情况，基于全国范围内的大样本量的数据解析，更全面、准确地评估我国奶制品质量安全情况。试验结果表明：5 080个样品中，234个样品检测出AFM1(AFM1污染发生率为4.6%)，仅0.7%的生鲜乳样品超出了欧盟的限量标准(50 ng/L)，并没有样品超出中国和美国的限量标准(500 ng/L)。2016年的检测结果远低于2010年的检测结果(78.1%[7]和32.5%[8])，这表明中国的生鲜乳质量安全正在不断的提高。这得益于中国政府对奶及奶制品质量安全的高度重视，目前奶及奶制品质量安全监测体系包含了良好生产规范(GMPs)、卫生标准操作规程(SSOPs)和危害分析与关键控制点管理(HACCP)等一系列的安全控制措施。这些措施的实施能够显著地降低生鲜乳中的AFM1污染，提高质量安全和经济效益[10-11]。2013—2015年奶业创新团队连续3年开展奶产品质量安全风险评估工作，3年的工作结果形成并发布了我国首个《中国奶产品质量安全研究报告》，用数据对我国现行奶产品质量安全水平做了最好的诠释和分析，我国奶产品质量为历史最好水平。与国内其他食品相比，我国奶制品的不合格比例远低于整个食品行业的不合格比例，我国奶制品是名副其实的安全食品。国家食品药品监督管理总局公布的数据显示，2015年国家食品安全监督抽检中合格食品166 769批次，不合格食品5 541批次，合格率96.8%，不合格率3.2%；奶制品中合格产品9 306批次，不合格产品44批次，合格率99.5%，不合格率0.5%。与国际奶产品相比，当前我国奶产品质量安全整体上也已经达到较高水平。在欧盟官方的食品与饲料快速预警系统(RASFF)2013年年度报告中，食品不合格通报3 137起，其中奶产品相关43起，占1.4%；2014年年度报告中，食品不合格通报3 097起，其中奶产品相关66起，占2.1%。而2015年，我国国家食品药品监督管理总局发布报告显示，我国不合格食品5 541批次，其中不合格奶产品44批次，不合格奶产品仅占不合格食品的0.8%。这充分说明中国本土牛奶的质量安全已基本达到了国际先进水平。

我们将本次试验的结果与世界上其他国家生鲜乳AFM1污染情况进行比较和分析(表4)。尽管各个国家AFM1污染的发生率不同，生鲜乳中AFM1污染是一个全球普遍存在的问题。我国AFM1污染发生率(4.6%)高于新西兰(0)[12]和英国(3.0%)[13]，低于摩洛哥(27.1%)[14]、埃及(38.0%)[15]、克罗地亚(>46.1%)[16]、印度尼西亚(57.5%)[17]、巴基斯坦(71.0%)[18]、黎巴嫩(73.7%)[19]、尼日利亚(75.0%)[20]、苏丹(95.5%)[21]、巴西(100.0%)[22]、伊朗(100.0%)[23]和意大利(100.0%)[24]。本试验中，中国仅有1.1%的生鲜乳样品超出了欧盟的限量标准(50 ng/L)，与欧洲食品安全局的检测结果(0.4%超出欧盟限量标准)相近[25]，这一结果要优于摩洛哥(8.3%)[14]、巴西(14.0%)[22]、埃及(20.0%)[15]、克罗地亚(27.8%)[16]、意大利(44.0%)[24]、黎巴嫩(44.7%)[19]、尼日利亚(48.0%)[20]、巴基斯坦(58.0%)[18]、伊朗(80.6%)[23]和苏丹(83.3%)[21]。本试验的结果不仅能够全方面、准确地评估我国生鲜乳中AFM1污染情况，还为后续开展的生鲜乳中AFM1污染的管理和风险分析提供了数据支撑。生鲜乳的AFM1污染是一个全球性的问题，应当引起AFM1高发生率和高超标率(以欧盟标准为参照)国家的足够的重视。生鲜乳中的AFM1主要来源于饲料的黄曲霉毒素B1(AFB1)污染。当奶牛采食了受AFB1污染的饲料后，AFB1经肝脏代谢羟基化形成奶中特有的代谢产物AFM1危害人体健康。研究人员指出，在发达国家，良好的储存措施和严格的规定使得生鲜乳中的AFM1污染降低[26]。因此，有必要严格实施良好的储存措施，饲料原料和成品料应储存在仓库中，干草等粗饲料应存放在干草棚中。仓库要通风、阴凉、干燥、清洁、没有霉积料。干草棚应具有防雨、通风、防潮、防日晒的功能。加强日常饲料检测，饲料仓库要定期清理、消毒，对于发霉变质的饲料进行脱霉或无害化处理，切断黄曲霉毒素污染源。此外，尽量缩短产品库存时间，青贮饲料应现取现用，应及时盖上青贮窖口或者扎紧青贮袋口，以防发生二次发酵。在AFB1污染较多的情况下，合理使用黄曲霉毒素吸附剂，阻止、限制其从胃肠道吸收进入奶牛体内，从而在源头上降低饲料原料中AFB1的浓度[27]。同时，严格执行奶及奶制品质量安全监测体系，从而保障奶及奶制品的质量安全[26,28]。

表4 不同国家生鲜乳中AFM1污染发生率的比较和分析

克罗地亚生鲜乳中AFM1污染发生率是通过参考文献的数据计算得到的数值。

The data of AFM1contamination incidence in raw milk in Croatia was calculated from the reference.

值得注意的是，通过对4个季度污染情况进行分析，我们发现生鲜乳中AFM1污染发生率在冬季为11.2%，远高于春季、夏季和秋季(分别为1.5%、2.5%和4.5%)。本课题组前期的研究结果显示，我国的长江三角洲地区的生鲜乳中AFM1污染的发生率呈现明显的季节规律，冬季的污染发生率最高[29]。此外，河北省唐山市的生鲜乳质量安全监测结果指出冬季具有较高风险的生鲜乳AFM1污染[30]。我国的这些调研结果与世界其他国家的调研结果相一致，这些国家包含了克罗地亚[16]、巴基斯坦[22]、伊朗[31]、土耳其[32]、泰国[33]和塞尔维亚[34]。冬季缺乏新鲜的青绿饲料，较多地使用青贮饲料，而青贮饲料被许多学者报道易受黄曲霉毒素污染[35]。此外，奶牛在冬季产奶量高，为了提高营养水平，较多的使用精料，如玉米、花生柏和棉籽柏等，而这些精料容易受黄曲霉毒素污染[35]。当青贮饲料和精料储存不当时，在冬季更容易发生黄曲霉毒素的污染[36]。因此，有必要在冬季重点关注AFM1的污染防控，合理规范化青贮饲料和精料的储存和使用。

4 结 论

① 通过对2016年中国奶业主产区生鲜乳中AFM1污染情况进行分析可知，中国的生鲜乳质量安全正在不断的提高，并没有样品超出中国和美国的限量标准(500 ng/L)。

② 通过对4个季度生鲜乳中AFM1污染情况进行分析发现，有必要在冬季重点关注AFM1的污染防控，合理规范化青贮饲料和精料的储存和使用。