芳香烃受体调控肠道炎症的研究进展

李成良 齐广海,2 彭 鹏 方热军*

(1.湖南农业大学动物科技学院，长沙410128；2.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京100081)

多环芳香烃化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是重要的环境污染物，具有强烈的致癌性。Poland等[1]应用核素标记配体法测定技术证明一种受体可介导PAHs的毒性作用，而命名为芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)。以前研究多集中于AhR对环境芳香烃化合物的代谢反应，近年研究发现，AhR是参与免疫调节的关键因子，AhR存在于大多数免疫细胞，参与调控细胞增殖、分化、适应性及先天免疫细胞亚细胞群的细胞因子分泌[2]。AhR在调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)、辅助性T细胞17(T helper cells 17，Th17)、肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs)、固有淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)等自身免疫调节中具有重要作用。越来越多的研究表明，AhR在调控溃烂性结肠炎(ulcerated colitis，UC)、克罗恩病(Crohn’s disease，CD)、抑制肠道感染和维护肠道健康方面有重要作用，其对肠道炎症的调控已成为当前研究热点。

1 AhR的一级结构

AhR是分子量较大的蛋白质，是由805个氨基酸构成的转录因子，属于配体依赖性的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)超家族中的PAS(period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-single minded，Pre-Arnt-Sim)亚家族成员[1]。所有哺乳动物bHLH-PAS蛋白质具有相似的分子结构，表明AhR进化过程中具有高度保守性。AhR结构从N端到C端主要分成bHLH、PAS和C端谷氨酰胺富集区3部分(图1)。bHLH具有高度保守性，对基本生理活动具有重要作用，PAS包括重复序列PAS-A和PAS-B 2部分[3]。C端具有物种差异性，呈多态性，其蛋白质长度长短不一[4]。N端bHLH帮助DNA结合和蛋白质二聚化，AhR受体C端约50%的蛋白质富含谷氨酸，该区具有转录激活作用，保护相关辅酶因子的结合位点如E1A结合蛋白P300(E1 A binding protein p300，P300)和固醇受体共激活因子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC1)。PAS-B区为配体绑定区[5]，PAS区主要发挥DNA识别、与配体和分子伴侣蛋白质相互结合的功能。PAS-B结构域与AhR配体结合区相重叠，赋予了蛋白质之间的相互作用，如与热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)、成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的相互作用[6-7]。

图1 AhR的结构功能域

但由于AhR高级结构尚未被解析，其涉及与配体结合、转运等机制研究受到一定限制。近年来，研究者采用同源模建法，获得了AhR配体结合区三维空间结构[8]，该结构由5个β折叠和1个α螺旋构成，并包含1个疏水的配体结合口袋。目前认为配体结合口袋附近的芳香族氨基酸残基如谷氨酸(Gln)377、苯丙氨酸(Phe)318、Phe289、半胱氨酸(Cys)294，Gln317、苏氨酸(Thr)283等通过它们的芳香族侧链与配体的芳香环(所有配体都具有芳香环特征)之间产生的堆积力相互作用，实现配体与受体结合，其中Phe318在配体结合中起到关键性作用[8-9]。

2 AhR的配体

AhR需要配体激活才能发挥其相关功能，其配体至少具有芳香化合物结构特征和疏水性。传统意义上AhR配体主要有两大类：卤代芳烃(halogenated aromatic hydrocarbons，HAHs)和多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)，越来越多的研究显示，一些与二者结构上有很大差异的人工合成和天然化合物也可以与AhR结合，说明AhR具有高度的配体多样性特点[10]。AhR的配体主要包括外源性配体和内源性配体，表1总结了具有代表性的AhR配体[10-15]。

表1 代表性的AhR配体

3 AhR的信号传导过程

无配体时，AhR与辅助伴侣蛋白23(co-chaperone protein 23，p23)、HSP90和乙型肝炎病毒X相关蛋白-2(hepatitis B virus X-associated protein 2，XAP2)形成复合物，存在于细胞质内。AhR配体根据其分子量大小，通过被动运输、主动转运、易化扩散和胞饮等方式进入细胞内[16]。当配体与AhR结合后，该复合物构象改变，再与核输入蛋白β结合，从而控制复合物核质穿梭[17]。在核内AhR与芳香烃受体转运蛋白(AhR nuclear translocator，ARNT)组成异源二聚体。活化后的AhR-配体-ARNT异源二聚体与DNA片段上二噁英反应元件(dioxin-responsive element，DRE)也叫外源反应元件(xenobiotic-responsive element，XRE)特异结合而发挥转录作用，下游被调控基因的XRE含有共同核心序列(N-GCGTG-C)。

AhR激活诱导可氧化AhR配体的细胞色素酶P4501A1(cytochrome P-4501 A1，CYP1A1)，并导致配体的代谢清除与解毒。AhR-配体复合物入核和XRE/DRE区域相互联系时，4 h左右配体-AhR复合物会从核中移出并被相关酶如CYP1A1所降解。但当CYP1A1表达异常时，会耗尽细胞核内AhR配体，形成一个类似于AhR缺乏状态，从而影响后续基因表达，导致机体病变[18]。同时还存在2条独立通路防止AhR被过度活化：泛素/蛋白酶途径将激活的AhR降解及转运出核，芳香烃受体抑制因子(aryl hydrocarbon receptor repressor，AhRR)与AhR竞争结合ARNT。激活的AhR可诱导AhRR表达，达到对AhR通路活性的负反馈调节(图1)[19]。

4 AhR与炎症性肠道疾病(inflammatory bowel disease，IBD)

多位学者研究了AhR与肠道炎症之间的关系。Qiu等[20]发现无菌条件下与野生型小鼠(AhR+/+)相比，40%的AhR敲除小鼠(AhR-/-)出现了结肠炎，肠道组织出现了增厚和纤维化。小鼠肠道出现隐窝损伤和脓创、杯状细胞减少、腺体结构变形，炎症延伸至黏膜下层属于典型的IBD症状。Arsenescu等[21]在无菌条件下，使用右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导小鼠产生结肠炎，发现在饲喂DSS的7 d时间里，AhR-/-小鼠全部死亡。Monteleone等[22]发现，与对照组(健康人体结肠组织)相比，UC组和克罗恩病病人的AhRmRNA表达丰度显著下降，体重减轻。后期通过小鼠试验发现添加AhR拮抗剂后，加重小鼠结肠炎。这些试验说明AhR是维护肠道健康的必需因子，当AhR缺失或AhR表达受阻时，加重了肠道炎症。而AhR必须被各种配体活化后才能进入细胞核发挥相关功能。许多学者针对配体活化AhR介导肠炎信号在IBD模型中进行了大量研究[23-26]。

AhR：芳香烃受体 aryl hydrocarbon receptor；XAP2：乙型肝炎病毒X相关蛋白-2 hepatitis B virus X-associated protein 2；HSP90：热应激蛋白90 heat shock protein 90；ARNT：AhR转运蛋白 AhR nuclear translocator；DREs：二英反应元件 dioxin-responsive element；CYP1A1：细胞色素酶P4501A1 cytochrome P-4501A1。

图2AhR的信号途径

Fig.2 AhR signaling pathway[19]

李良子等[27]发现6-甲酰基吲哚并[3,2-b]咔唑(FICZ)可缓解DSS诱导的结肠炎，同时减少了促炎因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)表达，提高了抗炎因子白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的表达。DSS型结肠炎导致肠黏膜CYP1A1表达量下降，加入FICZ后明显增加了肠黏膜CYP1A1表达量。FICZ为色氨酸光化产物，是AhR重要的内源性配体，其不仅可以缓解DSS诱导肠炎，还可以缓解三硝基苯磺酸(trinitrobenenze sulfonic acid，TNBS)或是T细胞转移诱导型结肠炎[25-27]。许多研究也都得到了类似结果[28-29]。

以上研究表明，AhR在缓解炎症性肠疾病中具有重要作用，内外源性配体均可激活AhR信号通路，活化的AhR可缓解由AhR缺失、DSS和TNBS诱导产生的结肠炎，而非AhR配体(如二甲基亚枫)不能激活AhR通路，不能缓解肠道炎症。

5 AhR调控肠道炎症的主要方式

5.1 AhR调控肠上皮内淋巴及其相关因子

作为肠黏膜免疫系统的一个关键组分，IELs是存在与小肠黏膜上皮的一类独特的细胞群。IELs具有自然杀伤活性，并能分泌多种细胞因子，从而在免疫监视和细胞介导的黏膜免疫中发挥重要作用。Li等[30]研究发现，与其他淋巴细胞相比较，IELs可以表达高水平的AhR，随后将小鼠AhR基因敲除，发现小鼠小肠95%的IELs损失，而对淋巴结、脾脏的细胞比例和数量无影响。与野生型小鼠相比，肠上皮细胞周转受到影响，从而影响黏膜屏障完整性。伴随着IELs数量的减少，发现AhR-/-小鼠的颗粒酶A和B、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)和C型凝集素均显著低于对照组和吲哚-3甲醇(indole-3-carbinol，I3C)添加组。而Girardi等[31]认为敲除AhR会导致强烈的宿主免疫，造成IELs的免疫耐受。

Li等[30]移植来自小肠的富含AhR的肠道T细胞受体(T cell receptor，TCR)αβ(一种IELs细胞亚群)，可重建AhR-/-小鼠肠道上皮细胞。来自于对照组的骨髓细胞在缺失重组激活基因-1(recombination activating gene 1，RAG1)，甚至RAG1和AhR都缺失情况下可重建肠道IELs。AhR-/-小鼠骨髓细胞不能重建肠道IELs细胞，这说明活化的AhR是ILEs的一种细胞固有(cell-intrinsic)需求。AhR活性可直接影响IELs细胞池的维持。作者并没找到AhR直接调控IELs的靶基因的证据，但以前有报道，具有受体酪氨酸激酶c-kit基因突变的小鼠，表现为IELs细胞池容量显著下降，这种现象与AhR-/-小鼠表现非常相似。这表明AhR可能是通过c-kit基因的表达来调控IELs细胞池容量[32]。

Li等[30]给小鼠饲喂标准饲粮和纯合饲粮3周后，饲喂纯合饲粮组回肠CYP1A1(AhR靶基因)、TCRγδ+CD88αα+IELs数量显著下降，而给纯合饲粮加入200 mg/kg I3C后，IELs数量得到恢复，结肠炎得到缓解。且颗粒酶A和B，MMP-7和C型凝集素含量明显高于对照组和基因敲除组。研究发现ILEs可直接参与免疫监视作用，通过高表达量的颗粒酶诱导感染细胞凋亡[33]，MMP-7主要参与肠道损伤修复和α-防御素(α-defensin)的杀菌作用[34]。C型凝集素可直接分泌到肠腔清除革兰氏阳性菌[35]。

总结，配体激活AhR后可能通过调控c-kit基因表达，从而维持ILEs细胞池，保持肠上皮完整性，提高颗粒酶A和B及MMP-7、C型凝集素的表达，这几种因素共同作用，提高肠道修复和杀菌能力，从而缓解肠道炎症。

5.2 AhR调控肠道ILCs，维持肠道黏膜稳态平衡

ILCs既是固有免疫的效应细胞，又是获得性免疫的前体细胞[36-37]。ILCs位于肠黏膜固有层、肠黏膜的微小肠道隐窝斑(cryptopatches，CP)、孤立淋巴滤泡和派尔集合淋巴结，主要表达为孤儿核受体γt+(retinoid-related orphan nuclear receptors,RORγt+)ILC胞亚群。Spits等[38]发现ILCs是一个重要的肠黏膜稳态信号。

Qiu等[20]研究发现，成年AhR基因敲除小鼠，表现为RORγt+ILC程序性死亡增加，数量减少，添加FICZ后，可增加野生型小鼠和杂合子小鼠的RORγt+ILC数量，而对照组小鼠无影响。Lee等[39]发现当AhR缺失时，ILC(CD4+RORrt+ILC)数量显著下降。Kiss等[40]发现AhR-/-小鼠的ILCs数量扩增受到抑制，肠道第二淋巴器官微小肠道隐窝斑和孤立淋巴小结(isolated lymphoid follicles，ILF)发育受到抑制。以上研究都表明AhR信号参与调节ILCs细胞的增殖和存活。

Kiss等[40]发现AhR-/-小鼠表达低水平的kit(平均荧光强度3 500∶1 000)，给添加小鼠饲喂纯合饲粮、纯合饲粮加2 g/kg I3C和对照组饲粮(谷物基础饲粮，含有多酚芥子苷等)后，添加配体组和对照组均能激活AhR上调kit基因表达(平均荧光强度500∶2 000∶2 000)。这表明AhR直接调控kit转录。研究发现kit启动子具有典型的XRE[41-43]，染色体免疫沉淀反应分析发现，活化的AhR与kit启动子相结合，给RORγt+ILC添加AhR配体，可提高kit启动子中XRE的占有率[40]。kit是干细胞因子(stem cell factor，SCF)受体，SCF对维持肠道黏膜位点的ILCs细胞池非常重要[44]。采用含有SCF的RORγt+ILC进行体外培养证实了c-kit对出生后的ILCs增殖具有重要作用[40]。这表明AhR通路直接调控kit转录，从而调控ILCs细胞的增殖与分化。

Lee等[39]研究发现，给小鼠饲喂AhR配体二噁英(TCDD)后，可增加结肠肠腔Notch1和Notch2表达，而Notch被认为是AhR的目标基因[45-46]，且RORγt+ILC可表达Notch1和Notch2[46]，Possot等[47]通过体外培养来自于成人骨髓前体细胞的RORγt+ILC后发现，Notch2信号通路控制RORγt+ILC的产生，缺乏Notch信号通路的小鼠减少了RORγt+ILC的产生。Notch1和Notch2启动子含有XRE，使用AhR配体后，可诱导其启动子与AhR结合，从而进行后续调控[45]。这表明AhR通路同时调控Notch信号通路，从而调控ILCs的增殖与分化。

ILCs主要分泌细胞因子如白细胞介素-22(interleukin-22，IL-22)，其可诱导肠上皮细胞产生黏蛋白和抗菌肽，IL-22在肠道抵抗病原方面有着关键作用[48-51]。Lee等[39]研究发现，野生型小鼠肠黏膜固有层的ILCs和派尔集合淋巴结的细胞在白细胞介素-23(interleukin-23，IL-23)刺激下，产生大量IL-22，而AhR基因敲除小鼠几乎无IL-22分泌。AhR基因敲除小鼠很快就被感染，2周内全部死亡。Monteleone等[22]通过TNBS、DSS和T细胞转移诱导小鼠产生结肠炎，而添加AhR配体FICZ后，增加了IL-22分泌，缓解了小鼠结肠炎。Zelante等[52]研究发现，AhR基因敲除小鼠IL-22分泌受到严重的抑制，进一步试验发现，小鼠肠道抗真菌能力与IL-22含量和ILCs数量有关。Schiering等[53]发现，小鼠中CYP1A1基因的异常表达，会耗尽原生AhR配体，形成一个类似于AhR缺乏的状态。CYP1A1的全身或限制在肠道上皮细胞的组成型表达，导致肠道AhR依赖型3类ILCs亚型(RORγt+NKP46+、RORγt+NKP46-、RORγt+CD4+)数量减少，IL-22分泌减少，提高了鼠柠檬酸杆菌对肠道的感染，在食物中增加AhR配体的摄入，可平衡因过多AhR配体降解对肠道免疫功能损伤。

Islam等[29]试验发现，野生型小鼠添加色氨酸增加了AhRmRNA表达，活化AhR的促进了ILCs增殖，同时增加了IL-22含量，IL-22诱导再生蛋白3(regenerating protein 3，Reg3)和黏蛋白的分泌，提高肠道抗菌能力。

AhR可通过上调kit和Notch通路，这2条通路控制ILCs的增殖、分化和周转，维持ILCs细胞池稳定。当肠道受到细菌威胁时，ILCs先于T细胞发挥免疫作用，ILCs分泌IL-22，从而诱导抗菌蛋白Reg3和黏蛋白的分泌进行杀菌活动，维护肠道健康。当AhR缺失或缺少配体激活时，AhR激活通路受到抑制，ILCs增殖分化减少，导致IL-22分泌减少，增加了肠道感染。因此，AhR是维护肠道黏膜稳态的必需因子。

5.3 AhR参与调控Treg/Th17分化平衡，从而调节肠道炎症

Treg和Th17都来自于初始CD4+T细胞，两者分化途径和在肠道炎症发生过程中的作用相反。Treg具有抗炎和维持免疫耐受功能，Th17功能与之相反。鼠类模型研究发现这2种细胞之间存在某种平衡，抑制Th17可促进Treg生成。

Treg转录因子为叉头状/翅膀状螺旋转录因子(forkhead box protein3，Foxp3)[20]。Treg主要分泌白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，Treg受IL-10正调节，受IL-6、白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)负调节[54-55]。研究发现，CD25+、CD4+辅助性T细胞可抑制、甚至治愈结肠炎[56-57]。Th17转录因子为RORγt。Th17可产生特异性的致炎细胞因子白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)。Th17生成过程受IL-1β、TNF-α和IL-23的正调节[58]，γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、受白细胞介素-27(interleukin-27，IL-27)和白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的负调节。Th17还可分泌IL-21、IL-6、TNF-α等[59]。这些细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞。IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地介导了组织的炎症反应。Zhang等[60]试验发现，在UC模型小鼠体内Th17的分化及与其相关的RORγt、IL-17、IL-6的表达水平均增加，而Treg的分化及与其相关的Foxp3、IL-10的表达水平下降。在DSS诱导的结肠炎模型中，促进了辅助性T细胞1(T helper cells 1，Th1)和Th17的细胞因子(IL-17、IL-6)分泌[43]。

Qiu等[20]研究发现，AhR-/-小鼠促进了小肠初始CD4+T细胞转化为Th17，还发现AhR-/-小鼠Th17的转录因子RORγt表达量增加，促进了IL-17的产生，而Foxp3表达量下降。Singh等[24]采用DSS(3%)诱导小鼠产生结肠炎，结果发现，与DSS+载体组相比，DSS+TCDD组Treg的百分比和数量显著增加，而单独添加TCDD组和单独添加载体组的Treg百分比和数量只有轻微的增加。RT-PCR检测发现，与单独添加载体组比较，DSS+载体组显著下调FoxP3 mRNA表达，显著上调IL-17 mRNA表达。而添加TCDD后(DSS+TCDD)，这种情况得到改善；同时发现未使用DSS的小鼠组，与单独添加载体组相比，添加TCDD能上调Foxp3的表达，而不改变IL-17的表达。

为验证TCDD通过AhR诱导调控Treg的分化，研究者采用野生型小鼠C57BL/6(AhR+/+)和AhR-/-小鼠进行体内和体外试验，结果发现，TCDD促进了野生型小鼠的Foxp3表达，而对AhR-/-小鼠的Foxp3表达无影响。同时使用TCDD处理DSS诱导的UC小鼠，发现肠道淋巴组织中的Foxp3表达显著上调，而IL-17的表达没有显著变化，表明TCDD活化AhR后可诱导Treg的分化，而不诱导Th17的分化[24]。Islam等[29]研究发现，野生型小鼠添加色氨酸显著上调Foxp3表达，下调IL-17的表达。还有研究发现，犬尿氨酸与AhR结合后，可促进T细胞向Treg分化，并增强Treg的活性，同时Treg可再作用于树突状细胞(dendritic cell，DC)，通过DC促进其他调节性T细胞向Treg分化，形成一个正反馈的过程[61]。

研究发现，Foxp3和RORγt的启动子都具有XRE元件，因此活化的AhR可直接调控这2个转录因子。AhR可通过诱导RORγt/C2表达进而启动RORγt/C2信号转导通路，从而促进Treg的分化。RORγt缺陷型小鼠能够减少Treg的组织浸润并缓解自身免疫性疾病[62]。Foxp3是Treg的调节功能密切相关的特异转录因子，高表达的Foxp3转基因小鼠其Treg数量增加。Foxp3不是传统意义上与IL-2、IL-4和INF-γ基因启动子直接相互作用的转录抑制因子，而是通过阻断多种细胞因子表达所必需的活化T细胞核因子(nuclear factor of active T cells，NFAT)、核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活化，达到抑制相应细胞因子表达的作用[63-64]。犬尿氨酸可通过AhR依赖的方式使Foxp3和Treg增殖[65]。

一些新的研究表明，酪氨酸蛋白激酶-信号传导和转录激活因子(janus kinase-signal transducers and activatorsof transcription，JAK-STAT)信号通路在Treg的各种功能中都发挥着重要作用。如Chaudhry等[66]认为，Treg内的信号传导与转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STATs)活化可使Treg通过增加抑制性细胞分子和趋化因子受体的表达来抑制Th17炎性反应，而Treg内STAT3的缺失可导致结肠炎的发生。Quintana等[67]发现，活化的AhR可以通过调节STAT1来促进Treg的分化。在体外Treg/Th17生长分化环境中，STAT3的缺失严重削弱了Th17的分化，使Treg/Th17平衡向Treg方向移动。而AhR与其配体结合后，激活包括STAT3、NF-κB等在内的信号途径促使细胞向Th17分化[68-69]。

以上研究表明，AhR缺失促进了Th17的分化，增加了促炎细胞因子(IL-17、IL-21和TNF-α)分泌，减少了Treg细胞分化，加重了肠道炎症。而添加AhR配体后可促进Treg细胞分化，增加抗炎细胞因子(IL-10)分泌，抑制了Th17的分化，减少该细胞促炎症因子(IL-4、IL-10、TGF-β)的分泌。活化的AhR通过调控转录因子Foxp3和RORγt，以及通过JAK-STAT通路调节Treg和Th17之间的平衡。而有研究者认为，TCDD活化AhR后对Foxp3和RORγt的调控是通过抑制Foxp3的CpG岛甲基化，促进IL-17启动子区域甲基化，从而促进Treg的分化，抑制Th17的分化，维持Treg/Th17的平衡，从而减缓肠道炎症[24]。

6 小 结

近年来，关于AhR参与免疫调节尤其是肠道炎症调节的研究很多，本文简单综述了AhR参与肠道免疫的稳态平衡，缓解肠道炎症。AhR失活会加重IBD病人肠炎，而各类配体可激活AhR有助于激发下游调控基因表达。通过维护和发挥IELs和ILCs相关功能、保护肠黏膜上皮完整、增加抗炎因子、抑制促炎症因子从而缓解肠道炎症。

食物是AhR配体的最大来源，食物相关营养素如色氨酸、大豆异黄酮、花生四烯酸、槲皮素、黄芩素等均是AhR配体。这些配体进入肠道后与AhR结合，启动相关基因表达，从而调节肠道免疫。IBD病人多摄入蔬菜有助于缓解结肠炎，利于肠道健康。菌群代谢物如短链脂肪酸可调节AhR及其在肝脏及肠道中的靶点，而AhR信号通路可影响小肠菌群组成，从而调控肠道菌群平衡，维护肠道健康。因此，研究相关配体调控动物肠道炎症，受体、配体与肠道微生物之间的关系，可作为未来动物营养调控研究的方向之一。