牛膝多糖抑制沙门氏菌侵染猪小肠上皮细胞的研究

赵玉蓉 王耀东

(湖南农业大学动物科技学院，湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙410128)

肠黏膜屏障可有效地阻挡肠道内微生物及其毒素向肠腔外组织扩散和病原微生物的入侵[1-2]，而其黏膜上皮细胞间良好的紧密连接结构是维持肠黏膜发挥正常屏障功能和吸收功能的前提[3]。研究表明，紧密连接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的复合体，包括跨膜的闭锁蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudin)和细胞质密闭小带(ZO)1～3等多种蛋白[4-5]，一旦这些蛋白的表达和定位发生改变，就会诱导宿主细胞骨架重排、连接结构破坏，从而导致细胞通透性升高，对抗原物质的屏障功能减弱，病原体将通过上皮细胞进入机体，引发一系列肠道疾病[6-9]。沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌，可以通过诱导吞噬作用侵入肠上皮细胞并在含沙门氏菌液泡中存活和繁殖[10]，在养猪生产过程中，极易感染2～4月龄的仔猪，导致仔猪腹泻，甚至死亡[11]。庾庆华[6]研究表明，沙门氏菌SL1344和SARB21感染人结肠腺癌细胞(Caco-2)后，occludin、claudin-1、ZO-1等蛋白表达下降，分布分散，细胞间隙增大，细胞轮廓不清晰。牛膝多糖(Achyranthesbidentatapolysaccharides，ABPS)是从苋科植物牛膝中提取、分离、纯化得到的一种生物活性多糖，具有抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等系列作用[12]。陈清华[13]研究表明，饲粮中添加适量的ABPS能显著抑制肠道病原菌生长，显著降低仔猪腹泻发生率，但这是否与ABPS参与调控肠上皮细胞间紧密连接的形成有关目前鲜有报道。因此，本试验旨在以猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells-1，IPEC-1)为研究对象，人为感染沙门氏菌，探讨ABPS处理对沙门氏菌侵染IPEC-1的影响，以期为仔猪的健康养殖以及ABPS的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

IPEC-1、沙门氏菌817菌株均由德州农工大学兽医学院惠赠。

ABPS购自武汉东康源科技有限公司，纯度99%。

1.2 主要试剂及配制

DMEM/F12细胞培养基、0.25%胰蛋白酶、双抗试剂购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、细胞冻存液购自Gibco公司；D-Hank’s缓冲液、中性磷酸盐缓冲液(PBS)购自Biotopped公司；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)和SYBR Premix EX TaqTMⅡ(RR820A)试剂盒均购自宝生物(大连)工程有限公司；表皮生长因子(EGF)、ITS liquid Media Supplement(100 ×)购自Sigma公司。

100 mg/mL ABPS母液：称取ABPS粉末0.500 g，溶于5 mL三蒸水中，0.22 μm微孔滤膜抽滤器抽滤除菌，分装，-20 ℃保存。

LB液体培养基：分别称取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，加入950 mL双蒸水中溶解，用1 mol/L的NaOH调节pH到7.0，定容至1 L，121 ℃、20 min高压灭菌，4 ℃储存。

LB固体培养基：分别称取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，加入950 mL双蒸水中溶解，用1 mol/L的NaOH调节pH到7.0，定容至1 L，然后加入15 g琼脂粉，121 ℃、20 min高压灭菌，待冷却至50～60 ℃时，倒制平板。

基础培养基：95% DMEM/F12培养基+5% FBS+5 μg/L EGF+1‰ ITS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素。

5 mg/mL噻唑蓝(MTT)：称取0.5 g MTT，溶于100 mL PBS中，0.22 μm微孔滤膜抽滤器抽滤除菌，4 ℃避光保存。

1.3 主要方法

1.3.1 细胞培养

IPEC-1经活化后，培养在基础培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞生长至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下计数，收集细胞用于细胞传代或后续试验。

1.3.2 ABPS对IPEC-1增殖的影响

将细胞以1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200 μL基础培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别加入相应剂量的ABPS，使培养基中ABPS终浓度分别为0(对照)、50、100、200、400 μg/mL，分别继续培养12、24、48、72 h(每个时间点每个处理设6个重复孔)，加入20 μL MTT，继续培养4 h，吸弃培养基，加150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，摇床低速振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测吸光度值(OD值)。细胞增殖以OD值呈现。

1.3.3 沙门氏菌对IPEC-1的侵染

沙门氏菌的准备：细胞消化分板当天，挑取单个817菌落于5 mL LB液体培养基中，200 r/min、37 ℃摇床培养过夜(10～12 h)，然后取10 μL菌液于另1支5 mL LB液体培养基中，37 ℃恒温箱培养(20～24 h),1 000 r/min离心10 min，弃上清，用5 mL不含抗生素和FBS的基础培养基重悬细菌。

将细胞以5×104个/孔接种于24孔细胞培养板，每孔加入1 mL基础培养基，待细胞贴壁后，分别加入相应剂量的ABPS，使培养基中ABPS终浓度分别为0(对照)、50、100、200、400 μg/mL(每个处理设5个重复孔)，37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，吸弃培养基，PBS润洗2次；每孔加入100 μL沙门氏菌悬液，1 000 r/min室温离心10 min，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h；吸弃上清液，PBS润洗2次；每孔加入含庆大霉素(100 μg/mL)无FBS的培养基1 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育2 h；吸弃培养基，PBS润洗3次；每孔加入200 μL 1% Triton X-100裂解液，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育5 min；每孔加入800 μL PBS，反复吹打，然后移入1.5 mL离心管，用PBS按10倍次方依次稀释。

每个LB培养皿(内径9 cm)中分别接种100 μL的上述裂解稀释液(10-3、10-4、10-5，每个稀释液重复3个培养皿)，用灭菌棒涂抹均匀，待菌液完全吸收后，倒置于37 ℃恒温箱培养18～24 h。

菌落数的计数(CFU/皿)：用计数器计数培养皿中的菌落数。

1.3.4 ABPS对IPEC-1紧密连接蛋白相关基因mRNA表达的影响

将细胞以1×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 mL基础培养基，待细胞贴壁后，分别加入相应剂量的ABPS，根据1.3.3侵染结果，本试验培养基中ABPS终浓度分别为0(对照)、50、200 μg/mL(每个处理设5个重复孔)，37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，吸弃培养基，PBS润洗2次；每孔加入1 mL Trizol，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。

cDNA合成：按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作说明书进行，反应结束后-20 ℃保存备用。引物均由上海生工生物有限公司合成，具体信息见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

实时荧光定量PCR：采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作说明书在CFX96荧光定量PCR仪进行定量分析。反应体系为：10 μL SYBR Premix EX Taq Ⅱ，2 μL稀释后的cDNA模板，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，双蒸水6.4 μL，反应程序为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，35个循环；熔解曲线从60至95 ℃逐步升温(每5 s增加0.5 ℃)获得。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因为内参，采用2-△△Ct法进行目的基因的相对表达量计算。

1.4 数据处理及分析

数据经Excel 2007初步整理后，用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，之后采用Duncan氏法进行多重比较，差异显著水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 ABPS对IPEC-1增殖的影响

由表2可知，用不同浓度ABPS分别处理IPEC-1细胞12、24、48、72 h后检测细胞增殖情况，发现在相同培养时间条件下各组间IPEC-1细胞活性均无显著性差异(P>0.05)。

2.2 ABPS对沙门氏菌侵染IPEC-1的影响

由表3可知，用不同浓度的ABPS处理IPEC-1细胞48 h，然后接种沙门氏菌，发现各组间细胞被侵染的沙门氏菌数量差异极显著(P<0.01)。统计分析结果表明，ABPS显著抑制沙门氏菌侵染IPEC-1，其抑制效果呈先增加后下降的趋势。培养基中添加50 μg/mL ABPS抑制沙门氏菌侵染IPEC-1的效果最强，极显著高于对照组和200、400 μg/mL ABPS组(P<0.01)，与100 μg/mL ABPS组的差异不显著(P>0.05)。

2.3 ABPS对IPEC-1紧密连接相关蛋白mRNA相对表达量的影响

由表4可知，不同组间IPEC-1紧密连接相关蛋白RAC1、ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA的相对表达量均存在极显著差异(P<0.01)。与对照组相比，0、200 μg/mL ABPS均显著上调RAC1、ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA的相对表达量。其中，RAC1 mRNA的相对表达量分别增加77%、48%；ZO-1 mRNA的相对表达量分别增加79%、64%；occludin mRNA的相对表达量分别增加125%、81%；claudin-1 mRNA的相对表达量分别增加218%、140%。与50 μg/mL ABPS组相比，200 μg/mL ABPS组的RAC1、occludin和claudin-1的mRNA相对表达量极显著下降(P<0.01)。

表2 ABPS对IPEC-1增殖的影响

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 ABPS对沙门氏菌侵染IPEC-1的影响

表4 ABPS对IPEC-1紧密连接相关蛋白mRNA相对表达量的影响

3 讨 论

大量研究表明，ABPS对肠道功能有改善作用，并且可以改善免疫系统。秦文雅[14]研究表明，ABPS可以改善LPS应激对肠道吸收功能以及免疫功能的影响。李孟伟[15]研究表明，细胞培养基中添加300～1 200 μg/mL的APBS能够显著地促进猪肠上皮细胞(IPEC-J2)的增殖，并且适宜的ABPS对IPEC-J2生长有一定的保护作用。本试验结果表明，与对照组相比，ABPS对IPEC-1的增殖无显著影响。

沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌，通常在动物肠道内感染，也会通过污染食物引起人类食物中毒。在各类细菌引起的食物中毒中，沙门氏菌中毒是最为常见的疾病之一[16]。在养猪生产过程中，由于仔猪的肠道功能发育不完善、免疫能力低下，沙门氏菌极易感染2～4月龄的仔猪，致使仔猪体温升高、精神不振、长时间发生腹泻、生长发育缓慢、停滞等，严重时发生败血症，最终导致仔猪死亡[11,17]。本研究结果表明，ABPS预处理的IPEC-1能显著抵抗沙门氏菌的侵染，此现象与陈清华[13]、马杰等[18]的报道相似，即饲粮中添加适量的ABPS能显著抑制断奶仔猪肠道病原菌的生长，一定剂量的ABPS在体外有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果。

小肠上皮细胞间良好的紧密连接结构是维持小肠黏膜发挥正常屏障功能和吸收功能的前提。而紧密连接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的复合体，其功能依赖于细胞连接蛋白、细胞骨架蛋白的正常表达和分布以及黏附连接的完整性。一旦这些蛋白的表达和定位发生改变就会导致细胞结构受损、通透性增高，各种病原菌及毒素经肠黏膜进入血液循环，引起肠道炎症[19-21]。庾庆华[6]体外(Caco-2细胞单层模型)和体内(大鼠)试验均表明，沙门氏菌SL1344和SARB21感染后，occludin、claudin-1和ZO-1等蛋白的分布较正常组分散，表达显著下降，细胞间隙增大，细胞轮廓不清晰。RAC1广泛表达于多种组织细胞内，在维持、增强和恢复内皮细胞屏障功能中发挥着重要的作用[22]。机体生理情况下基础水平的RAC1活性在细胞黏着连接和细胞骨架结构形成及维持两者连接上起着重要作用[23]。研究表明，运用RAC1抑制剂干扰抑制RAC1的活化，将导致黏着连接复合体的破坏以及细胞骨架肌动蛋白之间连接的破坏[24-26]。本研究结果表明，培养基中添加ABPS，能显著上调IPEC-1细胞紧密连接相关蛋白(RAC1、ZO-1、occludin、claudin-1)mRNA的相对表达量，显著抑制沙门氏菌的侵染，这说明ABPS能通过促进小肠上皮细胞紧密连接相关蛋白mRNA表达，维持肠道黏膜结构的完整，从而抑制病原菌的侵染。

4 结 论

① ABPS浓度在0～400 μg/mL对IEPC-1的增殖无显著的影响。

② ABPS处理后的IEPC-1能显著抑制沙门氏菌的侵染，随着ABPS浓度的增加，其抑制效果呈先增加后降低的变化。

③ 50、200 μg/mL ABPS可以显著上调IEPC-1紧密连接相关蛋白mRNA的相对表达量。