猪大肠杆菌的分离鉴定及其药敏试验

陈敏卿 龙岩市农产品质量安全检验检测中心 福建龙岩 364000

猪大肠杆菌病是由猪致病性大肠杆菌引起的，临床上主要引起仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，在我国各地均有发生，给生猪养殖业带来巨大的经济损失[1-3]。随着生猪规模化养殖的发展及抗生素的大量使用，同时又因大肠杆菌其血清型众多，抗原复杂，具有容易产生变异等特性，大肠杆菌菌株已产生广泛的耐药性和多重耐药性。因此，本试验通过细菌的分离鉴定，并筛选其敏感药物，从而有效的指导临床用药，达到最佳的治疗效果。

1 材 料

1.1 病料及来源 病料来源于福建省某规模化猪场疑似发生大肠杆菌病的仔猪，无菌采集猪淋巴结、肝脏、脾脏、肠内容物、肠系膜淋巴结等病料。

1.2 材料及试剂 营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基购置广东环凯微生物科技有限公司；药敏纸片购置北京天坛药物生物技术开发公司；DNA提取试剂盒、2×EasyTaq PCR Super-Mix等试剂购置全式金生物技术有限公司。

1.3 试验动物 清洁级昆明小鼠购置吴氏实验动物中心。

2 方 法

2.1 细菌分离培养及镜检 将病料接种于营养琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基37℃培养18～24 h，将可疑的大肠杆菌菌落接种于营养琼脂平板上，37℃恒温箱中纯化培养12～18 h。挑取单个菌落进行革兰染色，置于显微镜下观察镜检。

2.2 测序鉴定 选用通用引物27F/1492R扩增细菌 16S rRNA。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'，1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反应条件为：94 ℃预变性 5 min、94 ℃变性 40 s、52 ℃复性 40 s、72 ℃延伸 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经纯化和克隆，送往生工（上海）生物工程有限公司进行基因测序，将测序的结果与GenBank中公布的序列进行同源性分析。

2.3 动物致病性试验 参照文献方法[4]，将待检的菌株接种营养肉汤，37℃培养18 h，细菌计数后，将菌液稀释成1010CFU/mL。10只昆明小鼠随机分成2组，试验组腹腔接种0.3 mL菌液，对照组腹腔注射等剂量的生理盐水，隔离饲养，观察小白鼠死亡情况。

2.4 药敏试验 采用K-B药敏纸片纸法，将纯化的菌落涂布于琼脂平板上，将药敏纸片贴于培养基表面，置于37℃恒温箱培养，24 h后观察结果，并根据抑菌环直径来判定试验结果。

3 结 果

3.1 细菌的分离与镜检 经培养，在普通琼脂培养基上出现灰白色、稍隆起、圆形、湿润、光滑、边缘整齐的中等大小菌落（直径2～3 mm）；在麦康凯培养基上长出砖红色、光滑、湿润、圆形隆起、边缘整齐的菌落。革兰染色结果为中等大小、两端钝圆、散在排列、无芽孢，革兰阴性杆菌（见图1）。

3.2 序列测定及鉴定 分离的细菌PCR产物经1%凝胶琼脂电泳，出现预期的特异性条带 （见图2）。将测序结果采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行人工校对，然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，并与数据库中的序列进行同源性比较，结果发现分离的细菌与GenBank中公布的大肠杆菌16S rRNA序列同源性高达99.9%以上，确定分离的细菌为大肠杆菌。

图1 革兰染色结果

图2 猪大肠杆菌16S rRNA基因PCR结果

3.3 致病性试验结果 小鼠攻毒后24 h后，试验组的5只小鼠全部死亡，而对照组无出现死亡。试验组的发病小鼠出现精神沉郁、低头昏睡、体温升高、采食量大幅减少、腹泻、呼吸加快。剖检死亡小鼠可见肝脏肿大，有出血点和坏死点，心包淤血，肠道炎症膨胀，肠腔内充满水样稀便，说明本试验分离的大肠杆菌具有一定的致病性。

3.4 药敏试验结果 琼脂平板经24 h培养，用直尺测量药敏纸片的抑菌圈直径，分析该分离菌的药物敏感药物（见表1），结果发现该分离菌只对丁胺卡那和头孢喹肟敏感，而对庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林、强力霉素、磺胺嘧啶钠和林可霉素都存在不同程度的耐药性。

4 讨 论

1）猪大肠杆菌病在全世界范围内均有发生，在我国广泛流行，给生猪养殖业造成巨大经济损失。病猪主要表现为腹泻、浆膜性水肿等肠道症状，严重影响仔猪的健康，死亡率提高[5]。本研究通过对细菌的分离，并通过革兰染色镜检、PCR扩增和克隆测序鉴定，明确了本试验分离的细菌为猪大肠杆菌。同时，小鼠毒力实验表明该试验分离的猪大肠杆菌具有一定的致病性。

表1 药物敏感试验结果

2）目前，细菌的鉴定方法主要包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类，表型鉴定法主要是对细菌形态和生理生化进行鉴定，而分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定。生理生化表型鉴定常出现不稳定、敏感性不高、测试项目多、费时费力等问题。本试验先通过表型的细菌形态学观察初步确定细菌的种类，再通过PCR和16S rRNA序列测定，从分子遗传学水平对分离的细菌进一步鉴定，快速、准确的从细菌的表型水平再到分子遗传学水平对该分离菌进行了鉴定，确保了细菌鉴定的准确性。

3）猪大肠杆菌病感染后，使用敏感抗生素具有一定的效果，但大肠杆菌由于其血清型众多，抗原复杂，又具有容易产生变异的特性[6]和长期使用同类抗生素会造成细菌的耐药性，导致治疗困难。所以临床上有必要对发病的猪场进行分离鉴定并进行药敏试验，从而指导临床生产用药和防治。本试验药敏试验表明分离的猪大肠杆菌对庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林、强力霉素、磺胺嘧啶钠、林可霉素都表现为耐药性，只有对丁胺卡那和头孢喹肟敏感，说明本试验分离的大肠杆菌株具有多重耐药的特性，给生产上的治疗带来了巨大的困难。