HBV感染者病毒载量与外周血白细胞VCS参数的相关性探讨*

梁湘辉，樊树洁

(中南大学湘雅医院检验科，长沙 410008)

乙型病毒性肝炎目前是我国主要的传染性疾病之一，由乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染引起，以肝脏病变为主，并且可引起多器官损坏的一种疾病[1]。目前对于机体在HBV感染后，相关免疫细胞的变化，仍然缺乏一种方便、灵敏、有效而又经济的检测方法。血细胞分析仪可通过检测外周血白细胞体积(V)、电导率(C)、激光散射值(S)，反映其形态变化。为此，我们通过对HBV感染组与对照组外周血白细胞VCS参数比较分析，以了解机体在HBV感染后，白细胞形态的变化及其与HBV感染者病毒载量的相关性进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象 实验组为中南大学湘雅医院2016年9月～2017年5月HBV感染者200例，平均年龄38±11岁。根据其病毒载量分为：低于检测下限组(HBV DNA 103copies/ml)、低中病毒载量组(HBV DNA 103～107copies/ml)、高病毒载量组(HBV DN 107copies/ml)。对照组为同期健康体检者100例，平均年龄38±12岁。实验组和对照组排除标准：无血液病和其他感染性疾病。

1.2 试剂和仪器 贝克曼库尔特公司DXH800全自动血细胞分析仪及原装配套试剂、质控液、校准液、乳胶定标液。HBV免疫学标志物采用上海科华检测试剂盒。HBV DNA采用凯杰生物工程有限公司检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 检测指标：白细胞及VCS相关参数包括：中性粒细胞平均体积(MNV)、中性粒细胞体积分布标准差(MNV-SD)、中性粒细胞平均传导率(MNC)、中性粒细胞传导率分布标准差(MNC-SD)、淋巴细胞平均体积(MLV)、淋巴细胞体积分布标准差(MLV-SD)、淋巴细胞平均传导率(MLC)、淋巴细胞传导率分布标准差(MLC-SD)、单核细胞平均体积(MMV)、单核细胞体积分布标准差(MMV-SD)、单核细胞平均传导率(MMC)、单核细胞传导率分布标准差(MMC-SD)以及淋巴指数(lymph index)。HBV DNA载量和HBV免疫标志物检测。

1.3.2 标本采集：血细胞用EDTA-K2真空抗凝管采血2.0 ml，采血后立即颠倒混匀8次，采血后2 h内完成检测。HBV DNA采用EDTA-K2真空抗凝管采血2 ml，HBV免疫标志物采用无添加剂真空采血管采血2.0 ml。

1.3.3 质量控制：VCS参数定期用乳胶校准物进行调整。血细胞检测、HBV DNA和HBV免疫标志物均按项目要求进行室内质量控制，质控在控才能发出报告。

1.3.4 检测方法：所有标本血细胞检测、HBV DNA和HBV免疫标志物均严格按标准操作规程(SOP)进行检测。

2 结果

2.1 各组WBC及VCS相关参数的检测结果及组间比较 见表1。HBV DNA低于检测下限组和对照组比较：MNV，MNV-SD，MNC-SD，MLV-SD，MLC-SD，MMV，MMV-SD和MMC-SD差异无统计学意义(t=0.426～1.455，均P>0.05)；WBC，MNC，MLV，MLC，MMC差异有统计学意义(t=1.672～3.880，均P<0.05)。HBV低中病毒载量组与对照组比较：WBC，MNV，MNV-SD，MNC-SD，MLV-SD，MLC，MLC-SD，MMV和MMV-SD差异均无统计学意义(t=0.293～1.978，均P>0.05)；MNC，MLV，MMC，MMC-SD和淋巴指数差异均有统计学意义(t=2.003～4.409，均P<0.05)。HBV高病毒载量组与对照组比较：WBC，MNV，MNV-SD，MNC-SD，MLC-SD，MMV，MMV-SD和MMC-SD差异均无统计学意义(t=0.115～1.147，均P>0.05)；MNC，MLV，MLV-SD，MLC，MMC和淋巴指数差异有统计学意义(t=2.071～4.543，均P<0.05)。整个HBV感染组和对照组比较：WBC，MNV，MNV-SD，MNC-SD，MLV-SD，MLC-SD，MMV，MMV-SD，MMC-SD和淋巴指数差异均无统计学意义(t=0.101～0.795，均P>0.05)；MNC，MLV，MLC和MMC差异有统计学意义(t=2.747～5.468，均P<0.05)。

2.2 WBC及VCS参数的敏感度、特异度分析 各组差异均有统计学意义的检测指标做ROC曲线分析。HBV DNA低于检测下限组结果见表2。MMC曲线下面积最大，为0.669，敏感度和特异度分别为62.0%和68.0%。HBV低中病毒载量组结果见表3。MMC曲线下面积最大，为0.699，敏感度和特异度分别为74.0%和57.1%。HBV高病毒载量组结果见表4。MMC曲线下面积最大，为0.762，敏感度和特异度分别为62.0%和87.5%，MNC曲线下面积为0.736，敏感度和特异度分别为59.0%和87.5%，淋巴指数曲线下面积为0.703，敏感度和特异度分别为75.0%和63.0%。HBV感染组结果见表5。MMC曲线下面积最大，为0.697，敏感度和特异度分别为62.0%和72.0%。

表1 实验组与对照组WBC及VCS参数结果

注：t1，P1：对照组 vs HBV DNA低于检测下限组；t2，P2：对照组 vs HBV DNA低中载量组；t3，P3：对照组 vs HBV DNA高载量组；t4，P4：对照组 vs HBV感染组。

表2 WBC及VCS参数对HBV DNA低于检测下限组敏感度、特异度分析

表3 VCS参数对HBV低中病毒载量组敏感度、特异度分析

表4 VCS参数对HBV高病毒载量组敏感度、特异度分析

3 讨论

血细胞分析仪利用VCS技术对白细胞进行分析，Volume-体积，根据细胞通过小孔时电阻的变化测量细胞大小；Conductivity-传导性，与细胞的内部结构有关，可获得细胞核内复杂程度的信息；Scatter-激光散射，主要反映细胞内部颗粒特性。三种技术相互协调，从而对白细胞进行精确分类并能检测出各类白细胞VCS参数。

表5 VCS参数对HBV感染组敏感度、特异度分析

淋巴细胞是机体一种免疫活性细胞，分为T淋巴细胞和B淋巴细胞，T淋巴细胞参与细胞免疫，在机体有抗原刺激时，产生细胞因子，参与免疫反应；B淋巴细胞参与体液免疫，在抗原刺激机体时，产生抗体参与免疫反应。T淋巴细胞受抗原刺激后，转化为淋巴母细胞，其体积较大，形态不规则，胞浆量增多、可出现空泡，细胞核体积增大，染色质变得疏松，有核仁出现。B淋巴细胞受抗原刺激之后，在T淋巴细胞的辅助下增殖分化为浆细胞，其可产生抗体参与体液免疫反应。经过这个反应过程，可表现为淋巴细胞体积增大伴大小不一现象，胞浆量增多、浆中颗粒增加，核体积增大、染色质变得疏松并可有1～2个核仁等一系列变化，淋巴细胞以上这些形态的改变可以通过其VCS参数的变化来反映[2，3]。此外还有研究发现，在一些病毒感染的患者中，病毒抗原大多是在其淋巴细胞胞质中产生，从而导致淋巴细胞形态改变，体积增大，这也是引起MLV，MLV-SD变大的原因[4]。

本研究显示，淋巴细胞相关的VCS参数MLV，MLV-SD，MLC和淋巴指数在不同的HBV DNA病毒载量组中差异均有统计学意义，且随病毒载量增高MLV，MLV-SD呈增大趋势，MLC呈减小趋势，表明HBV感染后淋巴细胞呈现体积不均一性增大，且细胞的内部结构发生变化，传导率减低。淋巴指数(Lymph index)=MLV*MLV-SD/MLC，是一个关于淋巴细胞的综合指标，当淋巴细胞体积增大、体积分布宽度增加、传导率减低时，淋巴指数增大。

单核细胞在非特异性免疫和特异性免疫过程中发挥着非常重要的作用，是一类重要的抗原递呈细胞，具有多能造血干细胞的特性，在提呈抗原和分泌细胞因子的过程中其形态也会发生相应变化。主要表现为细胞体积增大，大小不一，胞浆内吞噬颗粒增加，复杂性增强等变化，从而导致单核细胞VCS参数也发生相应改变[5，6]。

本研究发现MMC在不同的HBV DNA病毒载量组差异均有统计学意义，且随HBV DNA的增高呈减低趋势，表示单核细胞的细胞内部结构发生了变化，导致其传导率减低。此外，病毒感染患者中，由于淋巴细胞是参与免疫应答的重要细胞，从而使其体内淋巴细胞激活，产生了被激活的体积较大的淋巴母细胞。体积较大的淋巴母细胞其形态类似于单核细胞，当前血液分析仪通过物理的方法进行VCS分析，其可能会把这类淋巴细胞作为单核细胞处理，从而导致单核细胞的VCS参数发生相应变化[4]。

中性粒细胞是人体血液中数量最多的白细胞，约占外周血白细胞的50%～70%，其也是机体重要的免疫细胞，参与组成机体固有免疫系统，具有趋化、吞噬、杀菌等多种生理功能，构建了机体抵御病原体入侵的第一道防线。当机体发生感染时，中性粒细胞在趋化因子作用下第一时间聚集到感染部位对机体实施保护。中性粒细胞受到微生物、细胞因子、化学物质等刺激后，其细胞形态和功能均发生变化。未受刺激静息状态下的中性粒细胞呈圆形，核染色质浓缩致密[8]。当受到刺激后，中性粒细胞形态变得扁平，细胞膜变得不规则，出现突起的伪足；细胞内膜完整性遭到破坏，细胞核染色质变得疏松、伸展、解凝聚，继而核膜崩解，释放DNA和组蛋白。核膜完整性的改变使染色质与核膜外胞质成分得以相互作用，核染色质的变化有赖于嗜苯胺蓝颗粒及中性粒细胞酯酶(NE)、髓过氧化物酶(MPO)等酶的作用，NE将组蛋白H1与核心组分分离，在MPO的协同作用下诱导核染色质疏松化，其会发生形态上的变化[7]，VCS参数也发生相应的改变。本研究发现MNC指标在乙肝病毒感染患者组比正常对照组减小，中性粒细胞在乙肝病毒感染后形态上的变化，导致传导率减小[9，10]。

综上所述，MNC，MMC，MLV，MLC和淋巴指数与HBV的感染存在一定相关性，可以通过其相关性辅助判断HBV的感染程度及治疗效果评估。