ACE基因rs4353，rs4461142和rs8066114位点多态性与心肌梗死的相关性分析*

贺继忠，李慧婷

(延安市人民医院心内科，陕西延安 716000)

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)形成、发展过程中所起到的作用已被越来越多的研究证实[1]。血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)作为RAS系统的重要成员之一，有研究发现血清ACE水平异常与冠状动脉粥样硬化及心肌梗死均密切相关[2，3]。既往研究发现ACE基因插入(insertion，I)/缺失(deletion，D)多态性可直接调节血清ACE生成及活性，与心肌梗死(myocardial infarction，MI)密切相关[4，5]。然而，目前ACE基因多态性研究主要集中在I/D多态性位点，对于ACE基因其他单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点与AS及MI相关性的研究目前鲜有报道。基于此，本研究根据中国汉族人的基因分型结果(publicdata release 21a/phase II.Jan.2007)，按照r2≥0.8，最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05的标准，选取ACE基因rs4353，rs4461142和rs8066114三个标签SNPs位点，观察其与MI易感性的相关性，为临床工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 MI组共纳入346例患者，其中男性217例，女性129例，平均年龄59.1±10.4岁。均选自2013年1月～2017年1月在本科住院治疗的急性心肌梗死患者，发病到入院<24 h。对照组共纳入300例患者，其中男性180例，女性120例，平均年龄58.7±11.0岁。均为同期经心电图、心肌酶谱及行冠状动脉造影等检查明确为非冠心病的住院患者。本研究所有研究对象均为出生并长期生活于陕西地区的汉族人，彼此无血缘关系。MI组和对照组性别和年龄构成差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂与仪器 日立7600全自动生化分析仪(日本日立公司)，ABI 9700 PCR扩增仪(美国ABI公司)，超微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)，DYY-10C型电泳仪(北京六一仪器厂)。三酰甘油(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)检测试剂购自瑞士罗氏公司。ACE ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，DNA抽提试剂购自北京天根公司，引物由上海生工公司合成，PCR试剂购自大连TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 一般临床资料收集：包括研究对象年龄、性别、体重指数、高血压、糖尿病、冠心病患病情况、吸烟史、饮酒史，以及TG，TC，LDL-C和HDL-C等生化指标，采用ELISA法检测患者血清ACE水平。

1.3.2 基因多态性检测：采集清晨空腹时外周静脉血以提取全血基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction -restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法检测ACE基因rs4353，rs4461142和rs8066114多态性。严格按照PCR扩增和酶切步骤进行，PCR引物，限制性内切酶及酶切产物见表1。最后，取酶切产物进行电泳，紫外灯下观察并摄片。

表1 PCR-RFLP反应相关参数

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较 见表2。MI组与对照组相比，两组体重指数、饮酒、TG，TC和HDL-C等指标差异均无统计学意义(均P>0.05)；两组在高血压、糖尿病、吸烟和LDL-C 4个方面差异具有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 两组患者血清ACE水平比较 血清ACE水平MI组(34.7±13.8 U/L)与对照组(30.6±12.0 U/L)比较，差异具有统计学意义(t=3.998，P=0.001)。

2.3 基因分型及Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 见图1。人群中ACE基因rs4353，rs4461142和rs8066114位点均包括三种基因型，本研究两组研究对象各位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。

表2 两组一般临床资料比较

(A：rs4353；B：rs4461142；C：rs8066114)

2.4 ACE基因多态性与MI易感性的关系 见表3。

表3 ACE基因多态性与MI易感性的关系[n(%)]

MI组与对照组比较，两组ACE基因rs4353位点基因型和等位基因分布频率差异具有统计学意义(χ2=8.146，P=0.017；χ2=7.585，P=0.006)；两组rs4461142和rs8066114位点基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(χ2=2.263～4.016，均P>0.05)。

2.5 对照组不同基因型血清ACE水平比较 见表4。对照组rs4353位点不同基因型血清ACE水平差异具有统计学意义(F=40.860，P=0.000)，AA基因型显著高于AG和GG基因型；rs4461142位点不同基因型血清ACE水平差异也存在统计学意义(F=3.382，P=0.035)，CC基因型高于CT基因型；rs8066114位点不同基因型血清ACE水平差异无统计学意义(F=0.176，P=0.840)。

2.6 多因素Logistic回归分析 见表5。以是否发生MI为因变量，选取单因素分析中差异有统计学意义的指标，包括高血压、糖尿病、吸烟和LDL-C，以及rs4353位点A等位基因为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示ACE基因rs4353位点A等位基因是MI危险因素，可显著增加MI发生风险(OR=1.620，95%CI 1.217～4.723，P=0.035)。

表4 对照组不同基因型患者血清ACE水平比较(U/L)

注：a与GG(rs4353)比较P<0.05；b与AG(rs4353)比较P<0.05；c与CT(rs4461142)比较P<0.05。

表5 多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

近年来，越来越多的研究表明肾素-血管紧张素系统(RAS)与动脉粥样硬化(AS)密切相关。ACE可将血管紧张素I水解为血管紧张素Ⅱ进而发挥强缩血管作用，是RAS系统的关键催化酶之一，也参与调节机体AS的发生发展过程。Daugherty等[6]研究发现高脂饮食可导致AS斑块内ACE表达增加，他们还通过构建ACE基因敲出小鼠模型，发现平滑肌细胞ACE基因敲出后可减轻AS进展。本研究结果显示心肌梗死(MI)组患者血清ACE水平显著高于对照组，与既往研究相符。ACE基因位于第17号染色体，全长21kb，包含26个外显子和25个内含子。其中位于第16号内含子的插入/缺失(I/D)位点是目前ACE基因多态性研究关注最多的位点之一，该位点直接参与ACE表达及活性调节。近来不断有研究发现ACE基因I/D多态性与高血压、MI等多种心血管疾病临床易感性相关[4，5，7，8]，早在1996年有荟萃研究发现DD基因型是白种人和日本人心肌梗死的危险因素[9]。在国内，朱艳霞等[10]纳入24个相关研究，共1 821例MI患者和1 951例对照组成员进行Meta分析，结果显示ACE基因I/D多态性与MI易感性相关。另外，还有研究发现ACE基因I/D多态性与糖尿病、吸烟、饮酒在AS的发病过程中存在协同作用[11]。

本研究所选取的rs4353，rs4461142和rs80 66114三个标签SNPs，共覆盖包括rs4343，rs4363，rs14251368等在内的22个SNPs信息。张阳东等[12]发现rs4353多态性与ACE表达密切相关，AA基因型人群血清ACE水平显著上升。研究认为rs4353参与ACE调节的主要机制在于该位点位于多个转录因子的结合区域，其多态性可影响DNA与转录因子的结合[13]。另外，rs4353能够捕获rs4343，两者完全连锁不平衡，rs4343多态性也与ACE水平密切相关[14]，提示rs4353多态性还可通过连锁其他SNP参与ACE表达调控。本研究发现rs4353位点AA基因型血清ACE水平明显升高，同既往研究结论一致。同时，本研究还发现A等位基因型是MI的危险因素，可显著增加在大动脉粥样硬化型(LAA)发病风险，也再次验证了高ACE水平可能增加MI发病风险。rs4461142位点多态性的相关研究较少，且多为单中心小样本数据分析，该位点基因多态性的生物作用尚未被广泛认同。本研究还发现rs4461142位点不同基因型患者血清ACE水平差异具有统计学意义，但未发现该位点基因多态性与MI存在明显相关性，笔者分析认为可能与本研究纳入样本例数不足相关，也进一步表明MI发病是多因素共同作用的结果，而非ACE表达异常单因素所致。最后，既往关于rs8066114位点研究也鲜有报告，其具体生物作用同样尚不明确，本研究结果显示该位点不同基因型患者血清ACE水平差异无统计学意义，该位点基因多态性与MI发病无明显相关性。

综上所述，ACE基因rs4353多态性可能与MI易感性相关，A等位基因可显著增加MI发生风险。但是，本研究仅为单中心研究结果，纳入样本量相对较少，检验效能低，期待后续多中心大样本研究结果加以验证。