山西猪伪狂犬病免疫与野毒感染情况调研

杜 彬，孟 帆，樊振华，吴 忻，赵 岳，薛翼鹏，米瑞娟，王娟萍，姚敬明，闫益波

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

猪伪狂犬病（PR）是由猪伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种高度接触性、急性传染病，猪是本病的天然宿主、贮存者和传播者[1-3]。该病毒破坏猪的神经系统、呼吸系统和免疫系统等，可引起猪群持续感染，终身带毒，现在已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。中国自1947年首次报道该病以来，随着养猪业集约化规模化的发展，许多种猪场呈暴发流行趋势。自20世纪80年代以gE基因为代表的基因缺失疫苗研制成功以后，许多国家应用gE基因缺失的伪狂犬病病毒弱毒疫苗，配合gE单抗ELISA鉴别诊断方法成功地扑灭了伪狂犬病。在我国gE基因缺失疫苗的广泛使用也使该病得到有效控制。但是2012年以来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的猪场出现了疑似伪狂犬病的临床症状[4-8]，而且这种状况在近两三年内已蔓延到全国二十多个省市的猪场。山西2013年以来也有母猪发生流产、仔猪疑似伪狂犬病死亡的类似情况，2016年、2017年、2018年项目组深入到山西不同地市，对11个规模型种猪场进行了猪伪狂犬病免疫防控和发病情况调研，同时采集血样和病料进行了野毒感染抗体（gE）和猪伪狂犬病病毒检测，现总结如下。

1 试验材料与方法

1.1 调研猪场与方法

在山西不同地市选择有代表性的11个规模型种猪场，调查了解免疫情况、母猪产仔情况、仔猪生长发育和病死情况，同时采集母猪和仔猪血样及时分离血清，-80℃冷冻保存备用；采集有神经症状病死猪的延脑、淋巴、脾等组织，放液氮中冷冻并研磨，-80℃低温保存备用。

1.2 检测试剂盒

猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测试剂盒（阻断法）由武汉科前动物生物股份有限公司生产；猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型PCR检测试剂盒由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产。

1.3 检测方法与判定标准

1.3.1 猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测方法（抗体检测按照ELISA检测试剂盒操作步骤进行） 试剂盒使用前各试剂应先平衡至室温；首先将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍洗涤液备用；将待测血清（冻存标本应平衡至室温并充分混匀）及阳性对照和阴性对照用标本稀释液按1∶1稀释。以上工作准备好，取出PRV包被板，记录阳性对照（2孔）、阴性对照（2孔）及待检标本，分别加入100 μL PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清及已稀释待检标本于相应孔中；接着用封板膜盖好反应板，置37℃温育30 min（gE蛋白45 min）后小心去掉封板膜，甩尽板孔中液体，向每孔中加200 μL 1倍洗涤液，静置3 min倒掉，重复5次，最后1次在吸水纸上拍干；然后向每孔加PRV酶标记物100 μL，用封板膜盖好反应板，置37℃温育30 min（gE蛋白20 min）后重复上面的洗板操作步骤，再分别向每孔中加底物液A、底物液B各1滴（50 μL），混匀，室温避光显色10 min；最后分别向每孔中加终止液 1滴（50 μL）终止反应，10 min内于630 nm波长酶标仪读板。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测：在酶标仪上测各孔OD630nm值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照孔平均OD630nm值之差≥0.3。S=样品孔OD630nm值，N=阴性对照孔平均OD630nm值，若S/N值≤0.35，样品判断为阳性，S/N＞0.4，样品判断为阴性，0.35＜S/N≤0.4，样品判断为可疑，必须重测，如结果相同，则判为抗体阳性。

1.3.2 猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型PCR检测方法（病毒检测按照PCR检测试剂盒操作步骤进行） 取-70℃保存的血清或组织混悬液上清液和阳性、阴性对照100 μL至1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min 离心 2 min，加入 200 μL 消化液和 20 μL蛋白酶K振荡混匀后，置56℃水浴中消化1 h；取出降至室温后，加入300 μL DNA结合液，颠倒混匀后移入吸附柱中，室温静置3 min，10 000 r/min离心30 s后弃去收集管液体，然后加入500 μL DNA洗涤液，10 000 r/min离心30 s，弃去收集管液体，重复加入500 μL DNA洗涤液洗涤后10 000 r/min离心1 min，将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，加入DNA洗脱液50 μL，室温放置2 min，10 000 r/min离心30 s，获取模板DNA。取2 μL模板DNA做PCR反应，取单管单份PRV PCR反应管，加入模板DNA、PRV阳性对照和阴性对照各2 μL，10 000 r/min顺时针离心30 s。将反应管放入PCR仪器的反应槽内，按下列反应循环条件进行扩增：94℃→3 min，后94℃ 30 s→65℃ 30 s→72℃ 30 s，共35个循环，再72℃延伸7 min。

最后取猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型PCR产物10 μL与2 μL上样缓冲液混合，加样于凝胶孔内，在阳性对照成立的条件下，1.5%琼脂糖凝胶确定在217 bp处有清晰目的条带（图1），判为猪伪狂犬病毒株和猪圆环病毒2型阳性（图2）。

图1 猪伪狂犬病病毒PCR反应产物结果

图2 猪圆环病毒2型PCR反应产物结果

2 结果

2.1 免疫与生产情况调查

被调研的11个种猪场主要使用上海海利生物技术股份有限公司、洛阳普莱柯生物工程有限公司、中牧实业股份有限公司、美国辉瑞生产的猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗，有8个猪场母猪采取普免（1年每季度免疫1次），仔猪1日龄滴鼻，35日龄、65日龄注射3次免疫；3个猪场母猪产前25～28 d跟胎免疫，仔猪 6～8周、10～12周 2次免疫。仔猪病死率为17.14%，有神经症状（疑似伪狂犬病）仔猪死亡率（占仔猪死亡数）为1.41%，具体见表1。

2.2 猪伪狂犬病野毒感染gE抗体检测结果

用猪伪狂犬病gE抗体检测试剂盒共检测母猪血样388头份，野毒感染阳性率为57.94%，仔猪血样727头份，阳性率为34.66%，11个场母猪野毒感染最高阳性率为83.33%、仔猪为70.00%，只有一个猪场仔猪没有检出野毒感染，详见表2。

表1 免疫与生产情况汇总

表2 猪伪狂犬病gE抗体检测结果

2.3 猪伪狂犬病PCR病原和猪圆环病毒2型检测结果

用猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型PCR检测试剂盒共检测病料125份，其中猪伪狂犬病病毒阳性19份，猪圆环病毒2型阳性43份，两种病混合感染阳性7份，详见表3。

表3 猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型PCR检测结果

3 小结与分析

（1）通过对11个种猪场调查证实大部分猪场母猪采取普免，仔猪采取3次免疫，仔猪实行1日龄滴鼻免疫后有效控制了初生仔猪口吐白沫、有神经症状及死亡，但2016年以来猪场母猪流产、仔猪疑似伪狂犬病死亡时有发生，可能与猪伪狂犬病病毒发生变异或毒力增强有关。

（2）猪伪狂犬病gE抗体检测证实猪群野毒感染率母猪为57.94%、最高感染率为83.33%；仔猪为34.66%、最高为70.00%，只有一个猪场仔猪没有检出野毒感染抗体。与雷宇平等报道2015年山西母猪群野毒感染率达49.06%，处于相对较高水平一致[9]。近几年大部分猪场都实行3次免疫，临床症状得到有效控制，但野毒感染率还较高，可能与环境控制、生物安全、频繁引种、频繁更换疫苗、病毒遗传变异、毒力增强等有关，需要进一步开展研究。11个猪场中只有一个猪场仔猪没有检出野毒感染抗体，该场实行自繁自养，连续3年全部用上海海利疫苗免疫，没有引进公猪，后备母猪从本场选留，环境控制较好，值得借鉴。

（3）对疑似伪狂犬病病死猪125份病料进行猪伪狂犬病PCR病毒检测出19份阳性，项目组对阳性病料进一步做了病毒分离鉴定和遗传变异分析，材料正在整理中。在病毒检测中发现，在临床症状上疑似猪伪狂犬病，但PCR病毒检出率较低，这可能与采样时间、部位、方法，以及采样后在-80℃冷冻时间较长等有关。要进一步查找有关资料，请教专家，尽快解决这一难题。

（4）按照国家《动物疫病防控中长期规划（2012—2020年）》要求，2020年我国种猪场达到PRV净化标准。血清学调查是制订净化策略的基础，本次检测发现母猪gE抗体阳性率高达57.94%，如果采取“淘汰清群”的净化方案，代价太大，且难以推广落实。目前国内的养殖模式，后备种猪一般都是从肥育阶段选留的。在PRV野毒阳性发病的猪场，肥育猪感染带毒率非常高，这增大了挑选出健康合格后备种猪的难度，不利于净化工作开展。在一些阳性稳定猪场，通过强化免疫、加强饲养管理和生物安全等综合防控措施，完全可以扩繁出阴性的肥育猪。因此，对于目前大多数阳性猪场，可以通过强化免疫，先稳定生产；坚持补充阴性后备种猪（自留或外购），自然淘汰阳性种猪，逐步完成净化。如果条件允许，可以实施“检测—淘汰”方案，以便加快净化进度。