评估3种不同毒株的猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果

林文耀，宋庆庆，刘玉梅，刘国民，黄 超

（金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以繁殖障碍、神经症状、呼吸道等为主要临床症状的一种重要传染病，严重影响养猪业的发展，早期由于疫苗的成功应用使得该病得到较好的防控。但自2011年以来猪伪狂犬病变异毒株的出现，给我国养猪业造成了较大的经济损失。主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，发病妊娠母猪流产，产弱仔、死胎；新生仔猪死亡率高，同时出现角弓反张等神经症状，病死率在10%～50%。病毒的分离鉴定表明疫病由变异PRV毒株引起，并且新流行毒株处于独立的进化分支，这对PR的防控提出了严峻挑战[1-3]。目前，疫苗仍然是防控猪伪狂犬病的主要手段。但是由于保护性抗原的变异导致传统的疫苗对新流行的毒株不能提供完全的保护[4-5]，而且中国兽药信息网的兽药基础数据库显示不同生产厂家的猪伪狂犬病疫苗批签发多达30多个，如何评估各个厂家不同毒株疫苗的免疫效果是养殖业迫切关心的问题。为了给猪场如何选择高效的疫苗提供参考数据，本文选择了市场占有率较高的3种不同毒株的猪伪狂犬病活疫苗，检测猪伪狂犬病gE、gB、中和抗体效价，评估不同毒株疫苗的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 试验疫苗

选取3种不同毒株的活疫苗，分别为A疫苗（国内最新分离株C株，江苏某公司生产，批号18251002），B 疫苗（HB2000株，湖北某公司生产，批号 171224），C 疫苗（Bartha-K61株，某进口产品，批号 L447795）。

1.2 试验猪场

某猪伪狂犬病gE抗体阴性的一点式生产的猪场，猪伪狂犬病疫苗的免疫程序：出生滴鼻1头份，70日龄肌注1头份，100日龄加强免疫1头份。试验期为2018年2月8日至6月18日。

1.3 试验设计

选取3栋产房依次编号为A、B、C。A产房的新生小猪滴鼻免疫A疫苗，做好耳号标记，如此类推。随机挑选分别滴鼻免疫了A、B、C疫苗的70日龄健康仔猪各30头（分别命名为A组、B组、C组），分别肌注A、B、C疫苗各1头份，100日龄加强免疫1头份。首次免疫前、二免前、二免后30d全组采血，分离血清，-20℃冷冻保存备用，分别进行猪伪狂犬病gE、gB、中和抗体检测。

1.4 方法

1.4.1 gE、gB抗体检测 采用海博莱公司生产的猪伪狂犬病病毒PRV-gE、PRV-gB抗体ELISA诊断试剂盒，检测按照试剂盒说明书的标准流程进行。

1.4.2 中和抗体检测 采集的试验猪只血清分别使用经典的HB-J毒株和分离到的变异毒株CW毒株进行细胞中和试验，检测血清中和抗体滴度，评判免疫效果。具体操作方法按文献进行[6]。使用GraphPadPrism6软件对每组的平均中和抗体效价分析显著性差异。

2 结果

2.1 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫后gE抗体检测结果

A组、B组、C组的猪伪狂犬病病毒gE抗体阳性率均为0，说明试验期间猪场没有受到猪伪狂犬病野毒感染。

2.2 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫后gB抗体检测结果

如表1所示，首免前A、B、C这3组gB抗体阳性率分别为66.67%、60.00%、60.00%，二免前、二免后30 d 3组的gB抗体阳性率均为100%，没有显著差异。

表1 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫后gB抗体检测结果

2.3 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫后中和抗体的检测结果

2.3.1 对比3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗体 如表2所示，A组疫苗在1次免疫30 d后对经典毒株HB-J和变异毒株CW都产生较高的中和抗体，高于B组、C组，差异显著。

表2 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗体

2.3.2 对比3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗体 如表3所示，与1次免疫比较，A组疫苗在2次免疫30 d后对经典毒株HB-J和变异毒株CW都产生较高的中和抗体，高于1次免疫后的滴度，差异显著。B组、C组在2次免疫后中和抗体提升不明显。

表3 3种不同毒株猪伪狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗体

3 分析与讨论

2011年以来，由于猪伪狂犬病病毒变异株的出现，我国多数地区相继暴发PR疫情，PRV阴性的免疫猪群发病的案例时有发生，说明传统的疫苗对新流行的变异毒株不能提供完全的保护。如何选择高效的疫苗预防PR疫情的发生，是整个养猪业迫切关心的问题。

本研究通过对比3种不同毒株活疫苗的免疫效果，发现首次免疫和2次免疫后，虽然3种疫苗gB抗体阳性率都达到100%，但是中和抗体的水平差异显著。总体而言，2次免疫后A疫苗对经典株和变异株都产生较高的中和抗体水平。B组、C组第2次加强免疫后产生的中和抗体水平与1次免疫差异不大，与我们实验室的检测结果相符：传统疫苗免疫多次后中和抗体效价依然偏低（数据未发表）。值得注意的是A疫苗对变异株的中和能力高于经典株，与B疫苗和C疫苗结果相反，可能与A疫苗为最新分离毒株，和新流行毒株抗原位点更匹配有关。

中和抗体是B淋巴细胞产生的一种可溶性蛋白，能够与病原微生物表面的抗原结合，使其失去感染力的抗体。伪狂犬病病毒的中和抗体有多种，包括gB抗体、gC抗体和gD抗体等。由于gB-ELISA试剂盒的方便使用，养猪业评估疫苗免疫效果往往只关注gB抗体的检测。但gB抗体只是中和抗体的一部分。gC和gD抗体同时也发挥着重要的作用。gC抗体可以抑制病毒在靶细胞上的黏附作用，gD抗体具有抑制病毒穿入的作用，可以有效阻断病毒的侵入[7-8]。而且gB抗体的检测采用的是竞争ELISA的方法，只能定性，不能定量，无法明确知道抗体的滴度。如本研究结果，gB抗体阳性率都达到100%，这单一结果无法有效评估疫苗的优良。因此，建议养猪业在评估猪伪狂犬病疫苗免疫效果检测gB抗体的同时，进行中和抗体的评估。可以通过中和试验评估中和抗体效价，检测血清的抗体中和病毒的中和效价，效价越高说明中和病毒的能力越强，可以有效提高感染的阈值，减少感染后的临床症状以及损失，缩短排毒时间和减少排毒量。后续，我们会进行A疫苗对经典株和变异株的保护效力试验，评估A疫苗与临床攻毒保护的直接关系。本研究A疫苗2次免疫后产生的中和效价高于活疫苗+灭活疫苗+灭活疫苗的免疫组合方案产生的中和抗体，可能与疫苗毒株的免疫原性，疫苗的生产工艺和抗原含量，佐剂等有关系，提示A疫苗可以作为防控猪伪狂犬病的高效疫苗[9]，有效简化现有“活+死”免疫组合方案，简化猪场免疫程序，降低疫苗成本。