TLR4信号通路在重症急性胰腺炎大鼠中介导肠黏膜炎症反应机制的研究

张婷婷　曾军　苏伟　陈伟明

【摘要】 目的：研究TLR4信号通路在重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠中介导肠黏膜炎症反应机制。方法：将20只SD大鼠随机分成SAP组和对照组，每组10只。SAP组采用4.5%牛磺胆酸钠逆行注射胰胆管建模（1 mL/kg），对照组则采用0.9%氯化钠溶液注射。比较两组大鼠小肠的NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平，血清TNF-a、IL-6、IL-10水平，以及胰腺、小肠组织病理评分。结果：SAP组大鼠的胰腺、小肠组织病理评分、血清炎症因子（TNF-a、IL-6、IL-10）水平、小肠NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

结论：TLR4信号通路在SAP的发展起到了重要的作用，作为炎症反应的“闸门”，可通过一系列信号转导调控炎性介质的释放和引起SAP各器官损伤，可能作为治疗SAP并肠黏膜屏障功能障碍的潜在靶点。

【关键词】 重症急性胰腺炎； 肠黏膜屏障功能障碍； 炎症介质； TLR4信号通路

Study on the Mechanism of TLR4 Signaling Pathway to Induce Intestinal Mucosa Inflammation in Rats with Severe Acute Pancreatitis/ZHANG Tingting，ZENG Jun，SU Wei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：0-036

【Abstract】 Objective：To study the mechanism of TLR4 signaling pathway mediated intestinal mucosal inflammation in rats with severe acute pancreatitis（SAP）.Method：Twenty SD rats were randomly divided into SAP group and control group，10 rats in each group.In SAP group，4.5% sodium taurocholate retrograde injection of pancreaticobiliary duct（1 mL/kg） was used，the control group was treated with 0.9% Sodium Chloride Solution.The activity of NF-κB and the levels of TLR4 protein and mRNA in the small intestine，the level of IL-10 in serum TNF-α and IL-6 in the small intestine，and the pathological score of pancreas and small intestine were compared between the two groups.Result：The pathological scores of pancreas and small intestine，the levels of TNF-a，IL-6 and IL-10 in serum，and the NF-κB activity and levels of TLR4 protein and mRNA in small intestine in SAP group were significantly higher than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：TLR4 signaling pathway plays an important role in the development of SAP，as a “gate” of inflammatory response，it can regulate the release of inflammatory mediators through a series of signal transduction and induce the injury of various organs of SAP，it may be a potential target for the treatment of SAP with intestinal barrier dysfunction.

【Key words】 Severe acute pancreatitis； Intestinal mucosal barrier dysfunction； Inflammatory mediators； TLR4 signaling pathway

First-authors address：Guangzhou NO.1 Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.008

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床常见的消化系统急腹症，主要由于高三酰甘油血症、肠道疾病、不规范饮食等多种因素导致胰腺内的胰酶被激活，从而引起胰腺组织水肿、坏死、出血等炎性反应，容易继发多器官功能不全（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1-3]。该病具有起病急、进展迅速、并发症多、病死率高等特点[4-5]。肠道屏障功能可防止肠道内细菌、细菌产物转移至肠道外进入机体[6]。肠黏膜炎症反应导致肠道屏障功能受损，通透性增加，细菌、毒素的体内迁移引发系统性炎症反应综合征（systematic inflammation response syndrome，SIRS），从而引起坏死的胰腺组织继发感染和MODS。Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）中的TLR4可通过介导一系列信号途径调控特定基因的表达，控制原发性致炎因子（TNF-α、IL-1等）的产生和释放，从而调控机体炎症反应，可能作为SAP时的SIRS、MODS的一个重要环节。因此本文将通过实验研究TLR4信号通路在SAP大鼠肠黏膜屏障功能障碍发病中的作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 20只SD大鼠由广州医科大学医学院实验动物中心提供；牛磺胆酸钠、PBS、甲醇、二甲苯等均购自Sigma公司；荧光定量PCR仪购自Thermofisher公司；WZ-50c型微量注射泵购自浙江大学医学仪器厂。

1.2 实验方法 将20只SD大鼠随机分为SAP组和对照组，各10只。两组SD大鼠术前12 h禁食，自由饮水。称重后于腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.5 mL

/100 g）（生产厂家：上海新亚药业有限公司，批准文号：国药准字H31021725）。动物麻醉后取仰卧位固定于手术台上并消毒，于上腹正中切口3 cm左右进腹，提取十二指肠并找到胆总管，随后用4号钝性针头对穿胆胰管乳头对侧十二指肠壁并插入胆胰管约5 mm，用无血管夹夹住针头。然后观察组以0.2 mL/min的速度注入5%牛磺胆酸钠溶液

（0.1 mL/100 g）（生产厂家：美国Sigma公司，批号：T0750-25），对照组以相同的速度注射相同体积的0.9%氯化钠溶液（生产厂家：河北天成药业有限公司，批准文号：国药准字H13022575），注射完成后保留3 min。最后依次松开血管夹，拔出针头，缝合关腹。两组均在造模成功后24 h活杀动物，鼠尾静脉留取外周血，取胰腺组织送病理检查，取小肠组织进行TLR4 mRNA、TLR4蛋白水平、NF-κB活性检测以及病理检查。

1.3 观察指标

1.3.1 胰腺和小肠组织病理评分 取胰腺组织和小肠组织送病理检查，采用Grewal法对胰腺、小肠组织的炎症、水肿、坏死、出血进行评分，其中炎症、水肿、坏死程度划分为5级，得分为0～4分，出血得分为0分（不出血）或者1分（出血），总分为13分，得分越高说明胰腺组织损伤越严重[7]。

1.3.2 小肠组织TLR4 mRNA 采用rizol法分离溶解小肠组织并提取RNA，经过处理后采用荧光定量PCR仪检测TLR4 mRNA在小肠组织中的表达，以β-actin为内参照，结果以TLR4 mRNA与β-actin的比值表示。

1.3.3 小肠组织TLR4蛋白水平 常规方法烤片40 min，经过脱蜡处理、封闭、孵育、标记、显色等操作后，最后苏木精复染，组织透明，树胶封片，取正常大鼠小肠组织作为阴性对照。光镜下随机选取5个视野，利用图像分析系统分析TLR4蛋白与内参蛋白灰度比值。

1.3.4 小肠组织NF-κB活性检测 取小肠组织，经过匀浆、离心等操作后取上清，采用Mercury转录因子ELISA法测定试剂盒测定NF-κB活性，以小肠组织细胞质、核染成棕黄色视为阳性，以400倍视野下阳性细胞所占细胞总数的百分率为阳性率。

1.3.5 外周血炎症介质水平检测 取外周血，低速离心后取上层血清，采用酶联免疫吸附（ELISA试剂盒）检测TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.4 统计学处理 本研究数据均采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况比较 SAP组10只，雌5只，雄5只，体重180～200 g，平均（191.22±3.34）g；对照组10只，雌5只，雄5只，体重180～200 g，平均（190.14±3.16）g。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组大鼠的胰腺、小肠组织病理评分情况比较 SAP组大鼠采用牛磺胆酸钠逆行注射胰胆管建模后24 h的胰腺、小肠组织病理评分均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 两组大鼠的血清炎症因子水平比较 两组大鼠的血清炎症因子水平存在显著差别，其中SAP组的TNF-α、IL-6、IL-10水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 两组大鼠的小肠组织指标检测结果比较 SAP组大鼠小肠组织的NF-κB活性、TLR4蛋白和mRNA水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

SAP产生时，肠黏膜细胞会因缺血、缺氧而引起炎症介质大量释放入血，从而导致肠道炎症反应和屏障通透性升高，肠道内细菌、毒素大量进入体内会造成全身性内毒素血症，继而引发SIRS、MODS等[8]。其中，NF-κB信号通路是内毒素活化的重要信号转导途径，当大量内毒素刺激细胞时，NF-κB会通过一系列信号转导调控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症相关介质及蛋白的表达[9-10]。而NF-κB调节产物的正反馈效应又能激活NF-κB，最终加重病情的恶化，从而诱发肺、胃肠道等组织器官的损伤[11]。进一步研究发现，NF-κB信号通路在调控下游炎症介质的同时，又受到TLRs等上游信号分子的調控[12]。其中，TLR4介导的信号通路通过髓样化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的依赖性途径介导NF-κB的活化和细胞因子产生[13]。即：TLR4只有通过识别配体（G-菌的脂多糖）后活化NF-κB，引起以TNF-α等为中心的前炎症因子激活，从而产生生物学效应[14-15]。因此TLR4信号通路在调控SAP时的肠黏膜炎症反应中具有重要作用。

本研究结果显示，SAP组大鼠的胰腺、小肠组织病理评分均显著高于对照组（P<0.05），说明SAP组大鼠胰腺、小肠组织存在严重的炎症反应，导致组织出血、水肿、坏死等损伤严重。SAP组大鼠小肠组织的TLR4蛋白和mRNA水平均显著高于对照组大鼠（P<0.05），表明大鼠TLR4信号通路被活化后，通过MyD88依赖性途径介导下游NF-κB的活化，使得NF-κB活性显著高于对照组大鼠，而NF-κB的活化又能促进TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子、炎症相关介质的表达，从而使得SAP组大鼠血清炎症因子水平显著高于对照组。由于炎症因子的正反馈效应，进一步活化NF-κB，使得SAP组大鼠血清炎症因子水平进一步增加。胰腺、小肠组织受到大量炎症因子的侵袭，最终使大鼠组织病理评分恶化。已有研究报道，罗格列酮、白藜芦醇抑制重症SAP大鼠NF-κB活性后，可有效降低血清TNF-α、IL-1、IL-6等的产生[16-17]，乌司他丁可能中断SAP大鼠胰腺组织中的TLR4、高迁移率族蛋白-1的信号通路而降低炎性介质的产生和释放，大黄可降低大鼠TLR4 mRNA、TLR2 mRNA的表达，从而对胰腺炎肠黏膜炎症有一定的疗效[18-20]。故而推测TLR4可能作为炎症反应的启动闸门，为治疗SAP并肠黏膜屏障功能障碍提供潜在的治疗靶点。

综上所述，TLR4信号通路在SAP的发展起到了重要的作用，作为炎症反应的“闸门”，可通过一系列信号转导调控炎性介质的释放和引起SAP各器官损伤，可能作为治疗SAP并肠黏膜屏障功能障碍的潜在靶点。

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（收稿日期：2018-05-03） （本文编辑：张爽）