安徽省玉米小斑病菌生物学特性的研究

赵真真, 郑训梅, 叶子园, 戴婧, 陈方新, 梅玉云

(安徽农业大学 植物保护学院， 合肥 230036)

玉米是世界上重要的粮食作物。除食用外，玉米还是畜牧业、轻工业和医药工业的重要原料。随着耕作制度的调整、气候条件的变化、玉米品种的更新及种植面积的不断提高，玉米在生长过程中特别是生长的中后期经常受到多种病原微生物的侵染和危害，从而造成玉米产量和品质的下降[1-3]。玉米小斑病(Corn southern leaf light)是世界各国玉米种植区危害较频繁的重要叶部病害之一，感病品种在一般发病年份可造成减产10%～20%，发病严重时导致玉米叶片提前枯死，产量损失可达30%以上，甚至颗粒无收[4-7]。在中国，玉米小斑病发生较为普遍和严重的区域主要分布在黄河及长江流域的温暖、潮湿地区，特别是在黄淮海夏玉米产区发病相对较重。夏玉米小斑病发生和流行受诸多因素影响，包括易感病生育期的气候条件、田间小环境、播种时间、播种密度和玉米品种抗病性等。众多研究表明，小斑病发生和流行的时间主要集中在7月中旬玉米进入生长中后期，此时，月平均气温在25℃以上、雨水多时易导致小斑病流行[8-12]。

玉米是安徽省重要的粮食作物和饲料作物。近年来，鲜食糯玉米和甜玉米在安徽省局部地区也有较快发展。随着玉米品种、种植面积和种植范围的不断扩大，其总产量也稳步提升。玉米南方锈病、弯孢霉叶斑病、大斑病、小斑病等叶部病害的危害也呈扩大和上升趋势。小斑病是安徽省玉米生长过程中的常发病害，在安徽淮北夏玉米主产区发生尤为严重[13-14]。小斑病在玉米各个生育阶段均可造成危害，抽雄后和灌浆期发病更为严重，主要危害玉米叶片，降低光合作用的有效面积，影响同化产物的积累[15]。该病的病原为玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolarismaydis)，属无性态真菌(Anamorphic fungi)中的丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌。小斑病菌是一种典型的非专性寄生菌，主要以菌丝体和无性态孢子的形式在玉米残体上度过逆境，其主要初侵染源是上个生长季节收获后留下的病株残体。本研究在安徽省玉米小斑病发生盛期，广泛采集田间病叶，通过组织分离法和单孢分离法分离获得小斑病菌菌株30株，研究了30个菌株的菌落特点、菌丝生长速率、分生孢子产生能力等生物学特性，旨在对下一步研究安徽省不同地理区域的小斑病菌菌株的致病性分化、抗药性及遗传多样性提供指导。

1 材料与方法

1.1 玉米小斑病病叶的采集

2016年8月，在安徽省玉米小斑病发生期采集具有典型症状的病叶，并装于牛皮纸袋中带回实验室，采集地主要在安徽省合肥、滁州、阜阳、六安、宿州、蚌埠、淮北和亳州8个地点[18]。

1.2 供试培养基

PDA培养基[16]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 mL，自然pH值。

WA培养基[16]：琼脂20 g，水1000 mL，自然pH值。

1.3 玉米小斑病菌的分离、纯化与鉴定

采用组织分离法和单孢分离法[16]。将具有典型症状的小斑病病叶沿病健交界处剪成4 mm见方的正方形小块。依次用0.1%的升汞溶液表面消毒2 min、75%的酒精浸泡30 s后，再用无菌水冲洗4次。将消毒后的病叶放在PDA平板上，每个平板放4块，将培养皿倒置放入25℃的恒温培养箱中培养。待病叶边缘长出菌丝后，用挑针挑取菌落前沿的菌丝块转接到PDA平板上，并通过单孢分离法进一步纯化。根据菌落形态、颜色、质地及无性孢子的形态特征对分离的菌株进行鉴定后备用。

1.4 玉米小斑病菌的生物学特性研究

1.4.1 玉米小斑病菌菌丝生长速率的测定

将鉴定后的30株小斑病菌转接到PDA平板上活化4 d后，沿菌落边缘制取菌饼(半径3 mm)，将菌饼转接到PDA平板中央，每个菌株重复4次。将上述各处理放置于25℃恒温培养箱中培养，培养至第3天，逐日测量并记载菌落直径，直至菌丝满皿[20-23]。

菌落净生长直径(cm)=菌落测量直径- 菌饼直径

1.4.2 玉米小斑病菌分生孢子产生量的测定

将方法1.4.1中培养10 d的小斑病菌菌株，在相同位置用打孔器制取4个菌饼后，装入含有1.5 mL 0.05%吐温-80水溶液的离心管中，并在涡旋振荡器上充分振荡2 min，使分生孢子均匀分散在溶液中。采用血球计数板观察400个小格的分生孢子数。每个处理4次重复，统计平均产孢量。数据处理采用DPS统计软件[24]。

1.4.3 玉米小斑病菌菌落特征、分生孢子形态观察及分生孢子大小测定

将小斑病菌在PDA平板上培养8 d后，观察并记载各个菌株的菌落特征。用0.05%吐温-80水溶液洗下供试菌株的分生孢子，在光学显微镜下观察分生孢子的形态和颜色，并用测微尺测量分生孢子大小。以30个分生孢子的平均值作为分生孢子大小。

1.5 数据处理

采用DPS软件，Duncan新复极差法处理，在0.05水平上分别分析差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 玉米小斑病菌的分离

通过组织分离法和单孢分离法从蚌埠、合肥、六安等8个玉米产区分离获得30个菌株，结合菌落形态、菌落颜色、菌落质地、产孢结构及分生孢子形态等特性鉴定30个菌株均为玉米小斑病菌，菌株编号及具体采集地点见表1。

表1 玉米小斑病菌菌株编号及采集地

2.2 玉米小斑病菌的菌丝生长速率

方差分析结果(表2)显示，分离自安徽省8个地区的30个菌株在菌丝生长速率上存在显著差异。30个菌株的菌丝生长速率范围为0.40～1.33 cm/d。其中，FY1菌株的菌丝生长速率最大，生长速率为1.33 cm/d； 其次是FY2菌株；BB2菌株的生长速率最小，为0.40 cm/d。FY1菌株与BB2菌株的菌丝生长速率相差最大达0.93 cm/d。

2.3 玉米小斑病菌的分生孢子产生量

通过血球计数板计数的方法比较了30个菌株在分生孢子产生量上的差异。结果显示，30个菌株的产孢量存在显著差异。产孢量最大的菌株是BB7，培养至第10天时其产孢量为25.02×104个/mL；其次是HB1菌株，产孢量是16.53×104个/mL；菌株BB3的产孢量相对较低，仅有0.75×104个/mL；在分离得到的30个菌株中，产孢量最低的菌株是BB2，培养至第10天时仍未见其产孢(见表3)。结合30个菌株的菌丝生长速率(表2)发现产孢量和菌落生长速率没有必然的联系。

表2 玉米小斑病菌不同菌株的菌丝生长速率

2.4 玉米小斑病菌不同菌株的菌落特点和分生孢子大小观察

2.4.1 玉米小斑病菌菌落形态观察

将30个菌株分别转接到PDA平板上培养8 d后，分别观察并记载各个菌株的菌落颜色、形态和质地。发现不同菌株间在菌丝生长快慢和菌落颜色上存在较大的差异，特别是菌株CZ3、CZ1、HF2和BB7(图1)。菌株CZ3和CZ1分离自滁州市，其菌丝生长速率较快，菌落较大，质地疏松，颜色为灰白色，气生菌丝发达。HF2菌株分离自合肥市，菌落颜色较其他菌株深，菌落颜色呈黑色，质地紧密，菌落厚且隆起。BB7菌株分离自蚌埠市，菌落生长缓慢，菌落上呈现白色发达的气生菌丝，黑色的生殖菌丝少而稀疏。

图1 玉米小斑病菌不同菌株的菌落颜色及形态图

2.4.2 玉米小斑病菌分生孢子的大小比较

通过测微尺测量了相同培养条件下小斑病菌30个菌株的分生孢子长度和宽度，并对数据进行了统计分析。分析结果显示30个菌株的分生孢子大小存在显著性差异(图2、表4和表5)，8个不同地区分离的菌株在分生孢子大小上没有明显的规律性。由表4可以看出，在测量的30个菌株中，FY1菌株的分生孢子长度最大，30个分生孢子的平均长度为85.91 μm，最小的为BB2菌株，30个分生孢子的长度为38.78 μm。由表5可以看出，在供试的30个菌株中，分生孢子宽度最大的为FY3菌株，其分生孢子宽度为18.65 μm，最小的为BB1菌株，其分生孢子宽度为9.57 μm。

图2 玉米小斑病菌分生孢子形态

菌株号Number分生孢子长度(μm)Conidia length差异显著性(0.05)Differene significance菌株号Number分生孢子长度(μm)Conidia length差异显著性(0.05)Differene significanceFY185.91±0.28aCZ264.21±0.19defgBB684.36±0.23aSZ262.95±0.23efgFY383.27±0.19aLA362.12±0.16fghHB181.05±0.22abHB361.33±0.21fghiHF379.38±0.26abcCZ360.12±0.29fghiBB475.83±0.17bcdBZ360.01±0.11fghiLA175.21±0.20bcdCZ159.85±0.13fghiFY273.78±0.16cdeBZ158.32±0.24ghiLA273.12±0.24cdeHF257.11±0.18hijBZ172.24±0.18cdeSZ356.25±0.27hijkBB771.11±0.21cdeHF154.38±0.17ijkSZ170.94±0.15cdeBB153.03±0.20jkBB568.24±0.17deBZ252.11±0.16klHB266.22±0.25defBB350.22±0.25lBZ465.14±0.27defgBB238.78±0.27m

3 讨论与结论

玉米小斑病是玉米生长过程中常发的重要叶部病害，病重年份严重制约着玉米产量和品质。科研工作者对小斑病菌的致病性分化、生理小种的类型及鉴定、毒素的种类及致病机理、抗病品种的培育、遗传多样性等方面做了大量工作[17-20]。但中国地域辽阔，各个地区的气候条件、耕作习惯、种植水平及品种类型存在极大差异，病原菌的生物学特性、致病性和寄主的抗病性处于长期的共同进化中。在此过程中，环境的变化、品种的更替、管理水平的变化均可造成病原菌寄生适合度发生改变，这些改变可通过病原菌营养生长的快慢，繁殖体的产生量和菌株致病性等方面的变化表现出来。谢红辉[21]和代玉立等[22]研究了培养基的酸碱度、培养温度、营养条件对小斑病菌菌丝生长及分生孢子产生量的影响，结果发现温度对不同地区玉米小斑病菌的生长影响不大，但最适酸碱度、营养条件对产孢量的影响较大。

表5 玉米小斑病菌分生孢子宽度

安徽省地处华东腹地，淮河、长江将全省分为淮北、江淮和江南3大区域。玉米主产区主要集中在淮河以北，沿淮及其他地区种植面积相对偏少。受耕作制度、地形等多种因素的影响，玉米小斑病在安徽省不同地区发生具有一定的差异。本研究采用组织分离法和单孢分离法从安徽省合肥、阜阳、滁州等8个玉米产区分离得到30株玉米小斑病菌，比较了30株小斑病菌的菌丝生长速率、菌落特征、产孢量及孢子大小等生物学特性。结果显示分离自同一地区的不同菌株及不同地区分离的菌株间其产孢量，菌丝生长速率，孢子大小均存在显著性差异；不同菌株的菌落颜色、质地、大小存在明显差异。在菌丝生长速率方面，分离得到的30个菌株中，FY1菌株的菌丝生长速率最大，生长速率为1.33 cm/d； BB2菌株的生长速率最小，为0.40 cm/d。在产孢量方面，产孢量最大的菌株是BB7，培养至第10天时其产孢量为25.02×104个/mL；产孢量最低的菌株是BB2，培养至第10天时仍未产孢。在分生孢子大小方面，FY1菌株的分生孢子长度最大，最小的为BB2菌株；分生孢子宽度最大的为FY3菌株，最小的为BB1菌株。综合分析菌丝生长速率、菌落颜色、产孢量及分生孢子大小数据发现，菌落颜色较深的菌株其产孢量相对偏大，菌丝生长速率相对偏小，但上述生物学特性与采样地点没有直接的相关性。在下一步研究中，将进一步探讨生物学特性与致病性、抗药性及遗传多样性之间的相互关系，为指导安徽省玉米小斑病的防治奠定基础。