复方鹅绒藤凝胶膏剂抗炎镇痛作用研究

* 晓辉

1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000;2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123

复方鹅绒藤药方来源于临床经验方，由戟叶鹅绒藤、白花菜子等6味药材组成，主要用于肩周炎和腰肌劳损等多种外周关节炎性疼痛的治疗。戟叶鹅绒藤[1](Cynanchumsibiricumwilld)为萝藦科鹅绒藤属的植物，是新疆特产药材，多生于干旱及荒漠灰钙土洼地，苦，凉，入心经，具有化湿利水，祛风止痛的作用。白花菜子[2-3]为河北省习用药材，性味苦、辛，温，具有祛风除湿、活血止痛的功效，常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤及股骨头坏死等病症。此外，戟叶鹅绒藤具有生命力强、产量高的特点，是一种具有很高开发前景的新型药用植物。本实验采用小鼠热板法、冰醋酸扭体法、二甲苯小鼠耳肿胀以及慢性肉芽肿四种动物模型探讨复方鹅绒藤凝胶膏剂外用给药的镇痛抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 仪器 前列腺素E2(PGE2)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司)；电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂)；电子天平SE602F(奥豪斯仪器上海有限公司)；ZH-YLS-68智能热板仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；旋转蒸发仪(BUCHI Rotaucpor R-200.BUCHI Heating Bath B-490)；SHZ-D(Ⅲ)循环式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2 药物 戟叶鹅绒藤采于新疆石河子市，经石河子大学中药学专家陈虹教授鉴定为萝藦科鹅绒藤属植物戟叶鹅绒藤；消炎镇痛膏(云南白药集团股份有限公司)；0.9%生理盐水注射液(新疆华世丹药业股份有限公司)；75%乙醇(天津市光复精细化工有限公司)；蒸馏水；0.6%醋酸。

1.3 动物 昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼用，体重(20±2)g，购自新疆医科大学医学实验动物中心，合格证编号SCXK(新)2011-0003。动物饲养于标准环境:温度(20～22℃),相对湿度(60～65)%,人工光照, 12 h明暗周期。

1.4 方法

1.4.1 有效部位提取及凝胶膏剂制备 分别称取复方鹅绒藤处方中6味药材3 kg，适度粉碎，置于大烧杯中，加浓度为75%的乙醇搅拌浸泡12 h，浸泡后置于圆底烧瓶内，用10倍量浓度为75%的乙醇搅拌并加热回流提取3次，每次2 h，取滤液于旋转蒸发仪中，65℃以下减压浓缩至黑褐色浸膏，出膏率为17.8%，进一步浓缩至相对密度为1.20～1.24(60℃)。

在提取出的复方鹅绒藤浸膏中按比例分别加入NP-700、卡波姆、甘羟铝、酒石酸、甘油、氮酮、丙二醇涂布，放置成型，制得药物凝胶膏剂。以小鼠腹部皮肤为渗透介质，20%乙醇-生理盐水为接收液，用改良Franz扩散池装置测得所制药物贴膏中总黄酮24 h累积渗透率为28.181%。

1.4.2 复方鹅绒藤凝胶膏剂对醋酸所致小鼠扭体的影响 选取小鼠60只，雌雄兼用，体重在(20±2)g，用电动剃毛器除去腹部被毛，随机分为5组，每组12只，分别为模型对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。模型组小鼠腹部粘贴不含药物的空白贴膏，阳性组粘贴消炎镇痛膏，低、中、高剂量组分别粘贴的复方鹅绒藤凝胶贴膏规格分别为13 mg生药/cm2、26 mg生药/cm2、52 mg生药/cm2，各组贴片均为圆形，直径2 cm。实验前用酒精棉擦拭小鼠腹部皮肤，之后各组贴膏粘贴于小鼠腹部皮肤，持续24 h，其间小鼠束足，24 h后除去贴片，解放小鼠束足，使小鼠充分活动30 min后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，之后立即记录15 min内小鼠扭体次数，计算药物的镇痛百分率：

镇痛百分率(%)=(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100%.

1.4.3 对小鼠热板实验的影响 雄性小鼠因受热阴囊触及热板，可出现假性结果，本实验采用雌性小鼠(20±2)g。于实验前在(55±0.5)℃的恒温水浴中放入玻璃烧杯，将小鼠放于其中，以小鼠舔后足为疼痛反应指标，测定每只小鼠的初始痛阈值。痛阈值在5～30 s内为合格动物(即对热敏感)。将痛阈合格的60只雌性小鼠随机分为6组，每组12只，进行足部贴敷给药，贴片直径1 cm，给药方法参照“1.2.2”，在 0.5 h、1 h、2 h、4 h按上述基础痛阈值测定法分别测定各小鼠的痛阈值。超过40 s不舔足者按40 s计。记录小鼠给药前后痛阈值(s)，并进行统计分析。

1.4.4 小鼠耳肿胀实验 筛选体重(20±2)g合格小鼠60只，雌雄兼用，贴片直径8 mm，分组及给药方法同“1.2.2”，每组12只。实验前小鼠禁食不禁水12 h，右耳贴敷给药，结束给药30 min后，于小鼠右耳前后两面用20 μL二甲苯均匀涂抹，左耳不做任何处理，作为对照，2 h后将小鼠处死，分别在左、右耳同一部位用打孔器打下直径为8 mm小鼠耳片，分别称重，计算左、右耳片重量之差，用来评价炎症肿胀程度，分别计算并记录各给药组的耳肿胀抑制率和肿胀率。计算方式如下：

肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100% ；肿胀率(%)=[右耳片重(g)-左耳片重(g)]/左耳片重(g)×100%。

1.4.5 慢性肉芽肿实验 筛选体重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，麻醉后，于后肢一侧腹股沟处切口，皮下植入已知重量的灭菌棉球，切口缝合，术后2 h开始给药，贴片直径1.5 cm，分组及给药方法同“1.2.2”，每天更换新贴膏，连续给药5 d，于第6d处死，取出棉球，在烘箱干燥后，精确称重，与原棉球重量之差即为肉芽肿净重，比较各组肉芽肿净重。计算方式如下：

肉芽肿净重=术后棉球净重(g)-术前棉球净重(g);

小鼠肉芽肿胀抑制率(%)=(模型组肉芽肿平均质量-给药组肉芽肿平均质量)/模型组肉芽肿平均质量×100%。

1.4.6 炎症组织中PGE2含量的测定 取体重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，分组及给药方法同“1.2.3”，连续给药5 d，末次给药后30 min，对每只小鼠右足皮下进针于踝关节处注射0.1%角叉菜胶生理盐水溶液 0.1 mL ，注射后 8 h时，于踝关节下将致炎足全部剪下，称重，剥皮剪碎，生理盐水漂洗2 min，以滤纸吸干水分，加入适量生理盐水进行研磨，制备成匀浆液，以2500 r·min-1的转速离心30 min，收集上清液保存备用。测定时，严格按照PGE2酶联免疫检测(ELISA)试剂盒使用说明进行操作，测定炎性组织中PGE2含量。

2 结果

2.1 对0.6%醋酸所致小鼠扭体实验的影响 由表1可知，与模型组比较，消炎镇痛膏组、给药组低、中、高剂量均可明显降低醋酸致小鼠扭体次数，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 复方鹅绒藤凝胶膏剂对小鼠扭体反应的影响

2.2 对小鼠热板致痛的影响 由表2可知，与给药前痛阈值相比，消炎镇痛膏组能显著性提高小鼠的痛阈值(P<0.05)；复方鹅绒藤给药组低、中、高剂量无显著性差异；随给药剂量增加，给药组小鼠舔足反应出现时间无明显提高。

表2 复方鹅绒藤凝胶膏剂对热板法致痛小鼠的影响

2.3 复方鹅绒藤凝胶膏剂对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 由表3可知，与模型组比较，消炎镇痛膏组以及给药组低、中、高剂量均能显著性降低二甲苯所致小鼠耳肿胀度(P<0.05)。且随药物剂量增加，肿胀抑制率增加。

表3 复方鹅绒藤凝胶膏剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

2.4 对慢性肉芽肿的影响 由表4可知，与模型组比较，消炎镇痛膏组以及复方鹅绒藤中、高剂量组均能显著性抑制小鼠的肉芽肿生成(P<0. 05)；随给药剂量增加，肿胀抑制率增加。

表4 复方鹅绒藤凝胶膏剂对小鼠慢性肉芽肿的影响

2.5 对炎症组织中PGE2含量的影响 由表5可知，与模型组比较，复方鹅绒藤凝胶膏剂低剂量组在抑制炎症部位PGE2生成方面，差异无统计学意义，中、高剂量组与模型组比较，差别具有统计学意义(P<0. 05)，说明复方鹅绒藤凝胶膏剂能够显著抑制炎症部位PGE2生成。

表5 复方鹅绒藤凝胶膏剂对炎症组织中PGE2含量的影响

3 讨 论

炎症是具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应。前列腺素(PG)是花生四烯酸在环氧化酶作用下的代谢产物，PGE2是其中一个重要的炎症介质，其可以扩张血管、协同趋化因子的激活并通过增强血管壁通透性、大量吸引中性粒细胞从而引起发热，并导致痛觉过敏从而引起炎症反应的发生和发展[4]。除此之外，炎症发生时，大量氧自由基会伴随PGE2的产生而产生，氧自由基通过诱发脂质过氧化作用而引起细胞损伤。

复方鹅绒藤来源于临床经验方，已于临床应用20多年，多以戟叶鹅绒藤等6味药材混合研磨后制成普通膏剂，贴敷局部疼痛部位，以缓解如肩周炎和腰肌劳损等多种外周关节炎性病症，疗效受到肯定。但由于传统贴膏释药性能较差，载药不均匀，膏体易污染衣物等诸多缺点，使临床用药受到影响[5]。针对传统贴膏的不足，本课题前期已将其改造成现代凝胶膏剂，工艺可行、可靠。本实验采用四种经典动物模型对复方鹅绒藤凝胶膏剂是否仍具有抗炎镇痛作用进行研究。实验中复方鹅绒藤凝胶膏剂对三种模型(小鼠扭体、二甲苯致小鼠耳肿胀及慢性肉芽肿)均表现出良好的药用效果；而热板实验结果不显著，原因可能是两种致痛模型反映不同的作用机理，前者所模拟的为周围神经参与的炎症性疼痛，而后者模拟的为高位中枢神经参与的疼痛，说明复方鹅绒藤凝胶膏剂作为外用药对中枢神经的抑制作用较弱，而对周围神经参与的局部炎性疼痛有很好的抑制作用。通过对炎性足部中PGE2含量的测定，认为复方鹅绒藤凝胶膏剂的抗炎镇痛与抑制炎症部位PGE2的产生和释放有关，但具体抗炎机制有待进一步研究。