产聚谷氨酸菌株的筛选及其发酵物对辣椒生长及产量的影响

王 进，高 鹏，黄天悦，陈孝平

(武汉工程大学 环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205)

聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)通过γ-酰胺键结合形成的一种多肽[1]，其与蛋白质结构类似，但不具有蛋白质的空间结构。γ-PGA具有强吸水性、可吸附金属离子、可降解和良好的生物亲和性等优点，被广泛应用于农业、医药、食品、化妆品以及污水处理等诸多领域[2-4]。在农业方面，γ-PGA常被用作肥料增效剂和缓释剂[5-6]。由于γ-PGA具有强吸水性，且侧链残基带有大量的负电荷，故γ-PGA能够保持土壤水分，吸附阳离子如NH4+、K+等以保持土壤肥力。此外，γ-PGA还能螯合部分重金属离子[7]，改善土壤环境，利于植物生长。

γ-PGA最初被发现于炭疽芽孢杆菌，后来研究者发现，芽孢杆菌属的其他菌种如枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌等也有产γ-PGA能力。最近几年，枯草芽孢杆菌常被用作研究γ-PGA的模式菌株。γ-PGA产生菌常见于豆类制品中。谢婷等[8]从多种豆类发酵食品中筛得高产γ-PGA的枯草芽孢杆菌并对其发酵条件进行优化。禚优优等[9]从豆豉中筛到1株产γ-PGA的枯草芽孢杆菌，并将提纯的 γ-PGA应用于芜青油菜盆栽试验中，发现γ-PGA具有增肥效果。贾艳萍等[10]从豆豉和纳豆中分离筛选到2株产γ-PGA的菌株，经鉴定均为枯草芽孢杆菌，通过将其发酵液和蒸馏水分别添加到土壤中测失水率发现，γ-PGA发酵液具有保水性。与豆类制品来源菌相比，土壤来源的γ-PGA产生菌筛选难度更大，但同时获得的菌株更稳定且抗逆性较强。普通土壤难以筛选到γ-PGA产生菌，γ-PGA为芽孢杆菌荚膜的主要成分，能使菌体在高盐环境下吸收水分，产生耐盐性。依据这一点，姚俊等[11]从沿海地区采集盐分较高的土壤，并成功筛选到多株γ-PGA产生菌。芽孢杆菌因其良好的抗逆性和土壤适应能力常被用作微生物菌肥。目前，肥料增效方面的研究都是通过发酵提纯的γ-PGA与化肥混合来实施的，而产γ-PGA的菌株多为芽孢杆菌，可作为菌肥使用。为此，从1棵长势良好的梨树下采集土壤(盐分偏高)，筛选产γ-PGA菌株，对其进行鉴定，并对其固体发酵条件进行优化，然后以固体发酵物为菌肥，研究其对辣椒生长和产量的影响，以期为γ-PGA菌肥的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

土壤为果园梨树表层(10～15 cm)土壤。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15～20 g/L，用NaOH溶液调pH值至7.2，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

种子培养基：配方同LB固体培养基，额外添加1 g/L葡萄糖，但不加琼脂，于高压灭菌锅中121 ℃ 灭菌20 min。

发酵培养基：柠檬酸三钠16.8 g/L、L-Glu 20 g/L、甘油 80 g/L、NH4Cl 7 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl20.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，用NaOH溶液调pH值至7.4，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

固体培养基：固体基质(豆渣、酒糟、玉米粉)10 g、K2HPO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、MnSO4·H2O 0.005 g、CaCl20.0075 g、FeCl3·6H2O 0.002 g，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 产γ-PGA菌株的筛选 将土壤和豆豉放置于通风阴凉处，风干7 d，过孔径150 μm筛。分别取2 g土壤、豆豉样品与10 mL无菌水混合，振荡5 min,静置30 min。取1.5 mL上清液于EP管中，置于沸水中10 min,然后取1 mL处理好的上清液至盛有9 mL无菌水的试管中，进行稀释涂布。将涂布好的平板于37 ℃培养12 h。挑取高黏湿润并且能拉丝的单菌落进行划线保存。

1.2.2 产γ-PGA菌株发酵产物的鉴定 接种保存好的菌株于种子培养基中，37 ℃过夜培养14 h。然后按照3%接种量接种到含50 mL发酵培养基的三角瓶中，37 ℃培养72 h。用浓盐酸将发酵菌液的pH值调至3.2，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，将上清液加到截留分子质量为14 ku的透析袋中，用加有5 g/L颗粒活性炭的超纯水透析上清液至无色，然后将透析袋放入超纯水中4 ℃透析过夜。将透析液用旋蒸仪浓缩，向浓缩液中加入4倍体积预冷的无水乙醇，置于摇床上振荡30 min，收集白色沉淀物，进行真空冷冻干燥，得到乳白色粉状固体。称取0.1 g乳白色粉状固体于1 mL蒸馏水中配制成100 g/L溶液，取500 μL上述溶液于等体积的浓盐酸中，用安剖瓶密封后在110 ℃下水解24 h。用毛细管点上述水解液于硅胶板上，以100 g/L的L-谷氨酸标准品γ-PGA为对照，以茚三酮为显色剂，测定菌株产物是否为γ-PGA。

1.2.4 产γ-PGA菌株16S rDNA序列分析 将筛选到的产γ-PGA菌株进行扩大培养，用细菌基因组DNA试剂盒提取总基因组DNA。以菌株的基因组DNA为模板，采用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，扩增体系包含模板DNA 2 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，10×TaqBuffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各5 μL，ddH2O 8.3 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保温。将PCR扩增产物进行DNA凝胶电泳，在紫外光照下将目的条带胶块用刀片切下，用DNA回收试剂盒进行纯化回收。将纯化的DNA片段送至生工生物工程(上海)有限公司测序。将测序结果进行拼接，用MEGA 6.0对菌株的16S rDNA序列进行比对，构建系统发育进化树。

1.2.5 产γ-PGA菌株固态发酵条件的优化

1.2.5.1 最佳固体基质的确定 取一定量灭菌后的固体培养基加入无菌水分别使豆渣、酒糟、玉米粉质量浓度为20、40、60、80、100 g/L，3个重复，分别接种1.5 mL培养12 h的产γ-PGA菌株的菌液，置于恒温摇床中37 ℃培养72 h。取1 mL培养物于9 mL无菌水中，充分振荡混匀，静置30 min后，取上清进行稀释涂布。37 ℃培养12 h后计数，找出最佳固体基质。

1.2.5.2 培养基含水量的确定 用确定的最优固体基质配制培养基，加无菌水使其含水量分别达到50%、55%、60%、65%、70%，3个重复，接种1 mL培养12 h的产γ-PGA菌株的菌液，37 ℃培养7 d。取样1 g，进行稀释涂布并计数，确定最佳含水量。

1.2.6 产γ-PGA菌株对辣椒生长及产量的影响 试验设计3个处理:50 g灭菌土不加任何物质(T1)、50 g灭菌土与10 g灭菌的固体培养基混合(T2)、50 g灭菌土与10 g固体菌株发酵物混合(T3)。由于后期需要施肥，所以首先确定哪种氮肥更利于菌体生长。经试验发现，在NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素3种氮肥中，最有利于菌体生长的氮肥为(NH4)2SO4。用从华中农业大学购得的辣椒苗和校园里挖的土进行盆栽。盆栽前，先按照已经确定的最佳发酵条件进行固体发酵。称取4.71 g (NH4)2SO4和3.89 g KH2PO4溶于100 mL水中，用于后续施肥。2017年4月15日开始定植，每组10盆，每天定时浇足量的水，每周一浇水前施肥，每盆施1 mL肥料溶液。2017年7月10日开始收获，对株高、根长、挂果数、茎粗、产量进行统计。

2 结果与分析

2.1 产γ-PGA菌株菌落的形态特征与菌体的革兰氏染色情况

经筛选，从果园土壤中发现1个菌株WJ47的菌落呈淡黄色、不透明，边缘不整齐，表面湿润，中间有突起黏液(图1)。光学显微镜下的革兰氏染色结果如图2所示，WJ47菌体形态呈短杆状，革兰氏染色结果为阳性。由此，初步断定WJ47属于芽孢杆菌属。

图1 WJ47菌株菌落形态

图2 WJ47菌株的革兰氏染色情况

2.2 产γ-PGA菌株发酵产物的鉴定及黏均分子质量

2.2.1 发酵产物鉴定 由图3可知，WJ47菌株的发酵产物水解液和标准品γ-PGA的水解液迁移值相同，表明WJ47菌株的发酵产物为γ-PGA。

2.2.2 产物黏均分子质量 标准品γ-PGA和产γ-PGA菌株发酵产物γ-PGA的ηsp/c与c的关系如图4、图5所示，由外推法分别求出标准品γ-PGA的特性黏度为0.045 73 L/g，产γ-PGA菌株发酵产物γ-PGA的特性黏度为0.088 28 L/g，再将其分别带入到[η]=KMη1.49，已知标准品的分子质量为700 ku，可以计算出产γ-PGA菌株发酵产物γ-PGA的黏均分子质量为1 088 ku。

1、2、3分别表示L-谷氨酸、土壤来源菌株产物水解液、标准品γ-PGA水解液，图3 土壤来源菌株发酵产物染色情况

图4 标准品γ-PGA溶液黏度与浓度关系

图5 产物γ-PGA溶液黏度与浓度关系

2.3 产γ-PGA菌株的16S rDNA序列分析

基于16S rDNA序列的系统发育分析(图6)发现， WJ47为芽孢杆菌属(Bacillus)，在亲缘关系上与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)最近。

2.4 产γ-PGA菌株的固态发酵条件优化

2.4.1 基质 由表1可知，在同等质量浓度下，经以豆渣为基质的培养基培养后的WJ47菌落数远超以玉米粉和酒糟为基质的培养基。因此，选用豆渣作为后续固体发酵基质。

图6 菌株WJ47与相关已知菌株基于16S rDNA序列的系统发育树

表1 3种不同质量浓度基质对WJ47菌株生长的影响cfu

2.4.2 含水量 由图7可知，当培养基含水量从50%增加到55%时，WJ47菌落数稍微增加；当培养基含水量从55%增加到60%时，WJ47菌落数直线上升；当培养基含水量从60%增加到70%时，WJ47菌落数持续增加，但是增加幅度较小。因此，采用含水量60%的豆渣培养基进行固体发酵。

图7 不同固体培养基含水量对WJ47菌株生长的影响

2.5 产γ-PGA菌株对辣椒生长及产量的影响

由表2可知，与不含菌肥的T1处理相比，含有豆渣的T2、T3处理辣椒的株高、根长、挂果数、茎粗和产量均得到显著提高。这表明，豆渣作为菌肥的一部分，能有效促进辣椒植株的生长并提高辣椒产量。与不含WJ47菌株的T2处理相比，T3处理辣椒的株高、挂果数、茎粗等生长指标均显著提高，进而产量显著提高47%。这表明，WJ47菌株促进了辣椒的生长，并显著提高了辣椒的产量。综上，菌肥中的豆渣和WJ47菌株均能显著促进辣椒植株的生长，提高辣椒产量。

表2 产γ-PGA菌株对辣椒生长及产量的影响

注：同行数据后不同小写字母表示处理之间差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

本研究从土壤中筛到1株产γ-PGA的枯草芽孢杆菌WJ47，其黏均分子质量为1 088 ku。该菌株

的最佳固体发酵基质为豆渣，固体培养基的最适含水量为60%。盆栽试验结果表明，WJ47菌株能促进辣椒根系的生长，并提高辣椒产量。

与T1处理相比，T2、T3处理辣椒的株高、根长、产量、挂果数、茎粗等均得到显著提高，表明菌肥中的豆渣能促进辣椒的生长。豆渣中氮含量比较高，这可能是豆渣促进辣椒生长的主要原因。均含有豆渣的T2、T3处理中，T3处理辣椒的株高、挂果数、茎粗等均显著增加，且T3处理产量比T2处理显著提高47%，说明WJ47菌株能促进辣椒的生长，提高辣椒产量。与T2处理相比，T3处理含有WJ47菌株，能加速豆渣的腐化分解，为辣椒的生长提供营养。综上，WJ47菌株能促进辣椒根部的生长，提高辣椒产量。