强直性脊柱炎患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平与附着点病变的相关性研究

黄娴倩 陈勇 应银燕 彭勇 干敏芝 耿保庆 朱梦雅 应颖

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种病因及发病机制尚不明确的慢性炎性关节炎，以骶髂关节炎、附着点炎及脊柱融合为特征[1]。炎症、骨破坏、新骨形成是AS发展过程中3个典型病理改变[2]。附着点炎是AS病理改变过程的特征性改变。近年有研究表明，在AS炎性骨破坏过程中，某些炎性细胞因子并非直接参与破骨细胞的分化和激活，而是通过调节TNF-α、细胞核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）等分子间接发挥作用[3-4]。新近研究表明IL-34也参与了破骨细胞的诱导和分化[5]。

近年来，肌肉骨骼超声广泛应用于患者肌腱、关节病变的评估。由于附着点部位表浅，同时高频灰阶超声具有分辨率高的优点，操作者可观察到附着点部位肌腱、软骨及骨表面的细微改变。与MRI相比，肌肉骨骼超声在观察附着点肌腱结构、滑囊炎及骨侵蚀等方面同样敏感，且超声对疾病早期附着点钙化的发现优于MRI[6-7]。目前超声检查联合 TNF-α、RANKL、OPG 和IL-34血清学相关性分析的研究较少。本研究旨在通过检测血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平联合超声评估AS患者外周关节附着点病变，探讨上述细胞因子与超声评估附着点病变、实验室指标和临床指标的相关性，初步了解TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34在AS患者骨破坏中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年1月1日至2018年1月1日在本院风湿科住院或门诊的AS患者21例作为AS组，所有患者均符合美国风湿病学会（ACR）1984年修订的纽约AS诊断标准[8]，Bath强直性脊柱炎病情活动指数（BASDAI）≥4分，患者3个月内均未进行生物制剂、关节内糖皮质激素及其他免疫抑制剂治疗，并排除感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病。其中男6例，女15例；年龄14～78（44.48±19.77）岁。选取同期在本院风湿科住院或门诊的类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者21例作为RA组，所有患者均符合ACR 1987年修订的RA分类标准[9]，28个关节的疾病活动度评分（DAS28）≥2.6 分。其中男 3 例，女 18 例；年龄 31～72（47.62±9.17）岁。选取同期在本院体检中心体检的健康者41例作为健康对照组，其中男15例，女26例；年龄23～80岁（46.24±17.79）岁。3组性别和年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平检测 收集所有研究对象清晨空腹静脉血，以3 000r/min离心5min，取上清液分装至试管后立即放入－80℃低温冰箱保存备测。严格按照 TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34 ELISA试剂盒（上海桥杜生物科技有限公司，201803，96T）说明书进行操作，采用ELISA法检测血清TNF-α、RANKL、OPG和 IL-34水平。

1.3 超声评估AS患者外周关节附着点病变情况 采用意大利百盛MyLabTMOne超声诊断仪，线阵探头，由一位经过肌肉骨骼超声正规培训的风湿科医师进行超声检查。检查部位参照临床常见的外周附着点炎部位和格拉斯超声附着点评分（GUESS）系统设定，包括跖底筋膜、跟腱止点、股四头肌肌腱止点、股骨和胫骨内外髁肌腱附着点、髌韧带起点和止点。检查跖底筋膜及跟腱止点，要求患者俯卧位，双足屈曲 90°悬空置床边缘；检查股四头肌肌腱止点、股骨和胫骨内外髁肌腱附着点、髌韧带起点和止点，要求患者仰卧位或坐位，膝关节屈曲30°、下肢伸展。对跖底筋膜、跟腱止点、股四头肌肌腱止点、髌韧带起点和止点采用GUESS进行判读，股骨和胫骨内外髁韧带附着点主要记录附着部位骨侵蚀、骨赘、韧带厚度改变、韧带内钙化情况。每个部位分别行纵向及横向扫查。然后采用能量多普勒观察所有受检附着点处血流分布情况。

1.4 实验室指标和临床指标 收集患者ESR、C反应蛋白（CRP）等实验室指标及BASDAI、Bath强直性脊柱炎功能指数（BASFI）、Bath强直性脊柱炎计量指数（BASMI）、Maastricht强直性脊柱炎附着点炎评分（MASES）、强直性脊柱炎疾病活动度评分（ASDAS）、夜间疼痛视觉模拟评分等临床指标。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；相关分析采用Spearman秩相关。采用ROC曲线分析RANKL和IL-34对AS的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平比较 AS组患者血清TNF-α、RANKL和 IL-34水平均高于RA组患者及健康对照组，血清OPG均低于RA组患者及健康对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

表1 3组血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平比较（pg/m l）

2.2 超声检查AS患者外周附着点病变情况 21例AS患者均发现肌腱端异常。GUESS评分中位数2（1～3）分，关节积液个数30个，骨侵蚀关节数29个，骨赘关节数15个，采集到能量多普勒信号关节个数1个，存在附着点炎关节数30个。

2.3 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平与超声评估AS患者外周关节炎附着点病变指标相关性分析 AS患者血清RANKL和IL-34水平与超声评估附着点骨侵蚀关节个数（r=0.564和0.482，均P＜0.05）及附着点炎关节个数（r=0.634和0.545，均P＜0.05）均呈正相关，与GUESS评分、关节积液个数、骨赘关节个数、采集到能量多普勒关节个数均无相关性（均P＞0.05）。AS患者血清TNF-α和OPG水平与超声评估附着点GUESS评分、关节积液个数、骨侵蚀关节个数、骨赘关节个数、采集到能量多普勒关节个数、附着点炎关节个数均无相关性（均P＞0.05），见表2。

表2 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平与超声评估附着点病变的相关性（r值）

2.4 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平与实验室指标及临床指标相关性分析 AS患者血清IL-34水平与 BASDAI呈负相关（r=-0.454，P＜0.05），而与 ESR、CRP、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜间疼痛视觉模拟评分均无相关性（均P＞0.05）。AS患者血清 TNF-α、RANKL 和 OPG 水平与 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜间疼痛视觉模拟评分均无相关性（均P＞0.05），见表3。

表3 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平与实验室指标及临床指标的相关性（r值）

2.5 AS患者血清 TNF-α、RANKL、OPG 和 IL-34水平之间相关性分析 血清RANKL水平与血清OPG水平呈负相关（r=-0.461，P＜0.05），而两者与血清 TNF-α、IL-34水平及血清TNF-α水平与血清IL-34水平均无相关性（均P＞0.05），见表 4。

2.6 ROC曲线分析 ROC曲线显示血清RANKL和IL-34水平对诊断AS有较高的准确性，AUC分别为0.994和0.941，均P＜0.05。当血清RANKL水平≥125.85pg/ml，灵敏度为0.95，特异度为0.95；当血清IL-34水平≥728.15pg/ml，灵敏度为0.95，特异度为0.73，见图1。

表4 AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平之间的相关性（r值）

图1 血清RANKL和IL-34水平诊断AS的ROC曲线

3 讨论

AS是一种可严重影响骨平衡过程的炎症性关节疾病。在AS早期，患者主要表现为炎性骨破坏，但随着疾病进展，患者可同时出现炎性骨破坏和异位骨形成。近年来，研究发现多种细胞因子在AS骨破坏的发生、发展中发挥关键作用。

TNF-α是炎症过程中最早产生的细胞因子之一，研究发现其参与AS骨破坏过程。本研究中AS组患者血清TNF-α高于RA组患者及健康对照组，其血清水平与 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜间疼痛视觉模拟评分均无相关性，与Gratacos等[10]报道一致。其血清水平与超声评估附着点GUESS评分、关节积液个数、骨侵蚀关节个数、骨赘关节个数、采集到能量多普勒关节个数、附着点炎关节个数均无相关性，提示其水平高低可能不能直接反映AS患者外周附着点病变的情况。

RANKL、OPG为调节破骨细胞活性所必需，是造成炎性关节骨质破坏最重要的影响因素。在RA患者和RA动物模型中，许多证据表明RANKL/细胞核因子-κB受体活化因子（RANK）/OPG系统参与了局部的骨质侵蚀。研究发现AS滑膜中活化的T细胞及滑膜成纤维细胞能够产生RANKL，并与局部的骨质侵蚀有关[11]。Mori等[12]在Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠的局部关节通过原位杂交方法检测RANKL、RANK及OPG的表达，也得到了类似的结论。本研究中AS组患者血清RANKL水平高于RA组患者及健康对照组，其水平与超声评估附着点病变骨侵蚀关节个数及附着点炎关节个数均呈正相关，同时ROC曲线显示其AUC为0.994，进一步验证了上述理论，当血清RANKL水平≥125.85pg/ml，灵敏度为0.95，特异度为0.95；这些提示血清RANKL水平升高可能可以作为反映AS患者存在附着点病变尤其是存在骨侵蚀的有用指标。另外本研究中AS患者血清OPG水平低于RA组患者及健康对照组，而血清水平与超声评估附着点GUESS评分、关节积液个数、骨侵蚀关节个数、存在骨赘关节个数、采集到能量多普勒关节个数、附着点炎关节个数均无相关性，提示其水平高低可能不能直接反映AS患者外周附着点病变的情况。而血清 RANKL 和 OPG 水平与 ESR、CRP、BASDAI、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜间疼痛视觉模拟评分均无相关性义，提示两者血清水平高低可能不能反映AS疾病的活动。

IL-34发现于2008年，属于IL家族，其功能类似于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），IL-34可与M-CSF受体结合，是破骨细胞主要的功能性细胞因子，与破骨细胞的活化增殖密切相关。研究表明IL-34参与破骨细胞的诱导和分化，具体表现为在RANKL存在的情况下，IL-34可诱导破骨前体细胞的体外增殖和黏附；同时，IL-34能发挥促炎作用，进一步导致RA的骨破坏[13]。本研究中AS患者组血清IL-34水平高于RA组患者及健康对照组，其水平与超声评估附着点病变骨侵蚀关节个数及附着点炎关节个数均呈正相关，同时ROC曲线显示其AUC为0.941，当血清IL-34水平≥728.15pg/ml，灵敏度为0.95，特异度为0.73，提示血清IL-34水平可作为预测AS患者存在骨侵蚀的可靠指标。其血清水平与 ESR、CRP、BASFI、BASMI、MASES、ASDAS、夜间疼痛视觉模拟评分均无相关性，虽然其与BASDAI呈负相关，但因BASDAI主观因素较多，因此笔者仍认为其水平高低可能不能直接反映AS疾病的活动。邬秀娣等[14]研究发现AS患者血清IL-34水平明显升高，与本研究结果一致；他们的研究还发现血清IL-34水平与ESR、CRP均呈正相关，但本研究样本量较小，该结论需进一步扩大样本量来证实。本研究对AS患者血清TNF-α、RANKL、OPG和IL-34水平之间的相关性进行分析，发现血清RANKL水平与OPG水平呈负相关，而两者与TNF-α、IL-34水平及血清TNF-α水平与IL-34水平均无相关性，提示RANKL、OPG与TNF-α、IL-34在AS骨质破坏的病理过程中可能各自独立发挥作用。笔者推测IL-34可能直接参与了AS患者破骨细胞的增殖和分化，其可能存在独立于TNF-α的骨破坏机制，同时IL-34能在附着点部位发挥促炎作用，进而促进AS骨侵蚀的发生，尤其在局部的骨质侵蚀中发挥重要作用。

综上所述，AS患者血清中存在较高水平的IL-34和RANKL，两者血清水平可能可以作为反映AS患者存在附着点病变的有用指标，尤其是预测AS患者骨侵蚀的可靠指标，推测IL-34与RANKL参与了AS骨破坏的过程，是AS发生骨破坏病理改变过程中的重要因子，且两者在AS骨质破坏的病理过程中可能存在独立的骨破坏机制，进一步研究IL-34在AS骨破坏中的具体机制，可为AS治疗提供新靶点。抑制IL-34有望成为TNF-α抑制剂治疗无效的AS患者的新选择。