转录因子NF-E2相关因子2对急性肺损伤小鼠的保护作用研究

陈茜圆 黄晓军 任卓超 金兴

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭。ALI已成为严重感染、严重创伤和大面积烧伤等患者死亡的主要原因之一。ALI的发病机制仍未完全阐明，目前尚无强力的、安全有效的药物治疗手段。故进一步研究ALI的发病机制，探寻新的方法预防和治疗ALI，刻不容缓。研究表明，被激活的各种细胞经呼吸爆发产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起氧化应激状态，在ALI发病机制中具有重要作用[1-2]。在生理情况下ROS是通过细胞内抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）调控的相关解毒、抗氧化酶去除和降解的。Venugopal等[3]和Itoh等[4]最先提出转录因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）在驱动ARE调控基因中的作用，后续研究使得Nrf2参与ARE调控基因表达的机制越来越清楚[5]。目前研究已证实Nrf2在一系列高氧化应激状态的疾病中都有保护作用，并决定机体对氧化应激的敏感性和机体炎性反应的严重程度[6-8]。国外已有少量研究证实Nrf2在ALI中的保护作用，但在国内此类研究报道极少[9]。Nrf2的研究将为临床上ALI的预防和治疗提供一个新的靶点。本研究探讨Nrf2对ALI小鼠的保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6～8周雄性小鼠36只，清洁级Ⅱ级，体质量18～20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。室温(18～22℃)、安静环境中常规饲养，昼夜交替，自由适应环境1周后进行试验。

1.2 仪器和试剂 Gem premier 3000血气分析仪（美国GE公司）；IX51光学显微镜（日本Olympus公司）；凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad公司)；脂多糖（LPS）（美国Sigma公司）提供；Nrf2 小干扰 RNA（siRNA)、鼠抗人Nrf2单克隆抗体（美国Santa Cruz生物科技公司）；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α、IL-6、考马斯亮蓝染色法（Braford）蛋白含量检测、Western blot检测、全蛋白抽提检测和SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 实验动物分组及模型制作 采用随机数字表法将大鼠分为对照组、ALI组、Nrf2干扰溶剂对照组（干扰溶剂组）和Nrf2干扰组4组，每组9只。Nrf2干扰组于尾静脉注射Nrf2 siRNA 3mg/kg（溶于0.2ml干扰溶剂），而干扰溶剂组于尾静脉注射等量干扰溶剂（1×PBS，溶解随机序列siRNA），对照组和ALI组于尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续3d。第4天时，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组腹腔注射LPS 10mg/kg（溶于0.2ml 0.9%氯化钠溶液），制备内毒素诱发ALI模型；对照组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。注射LPS或0.9%氯化钠溶液6h后，配制10%水合氯醛经腹腔注射麻醉成功，再由腹主动脉取血，采用Gem premier 3000型血气分析仪进行血气分析，计算氧合指数[PaO2/吸入氧浓度（FiO2）]，以氧合指数≤300mmHg为 ALI模型制备成功的标准[10]。36只小鼠由下腔静脉取血，放血处死后，从胸腔中取出肺组织。

1.4 肺组织匀浆收集 取左肺组织用预冷的0.9%氯化钠溶液在玻璃匀浆器内充分匀浆，制备为10%组织匀浆。取0.45ml 10%组织匀浆用于测定MPO；剩余组织匀浆用低温离心机离心，10 000r/min离心10min，收集上清液置于-80℃保存，以备各项检测用。

1.5 肺组织病理学观察 取右肺副叶肺组织，0.9%氯化钠溶液浸洗后，10%甲醛固定，经梯度乙醇脱水置换、二甲苯透明后，常规石蜡包埋，切片，HE染色，Olympus IX51光学显微镜下观察肺组织形态学变化，参照文献[11]介绍的方法进行肺组织病理学损伤评分：（1）肺泡腔及间隔中性粒细胞渗出：无渗出为0分，可疑渗出为1分，散在渗出为2分，渗出较多或呈小灶状分布为3分；（2）肺泡间隔增宽：无增宽为0分，稍有增宽为1分，明显增宽为2分，丧失正常肺泡结构为3分；（3）肺泡腔出血：腔内无红细胞为0分，有少数红细胞为1分，红细胞较多为2分，红细胞几乎充满肺泡腔为3分；（4）肺泡腔纤维蛋白渗出：无渗出为0分，少许渗出为1分，渗出较多为2分，几乎充满肺泡腔为3分。取4项评分之和为肺组织病理学损伤评分。每张切片随机选取10个视野进行评分，取其平均值。

1.6 测定湿重/干重比值 取右肺尖叶肺组织，称湿重，置入80℃烘箱内烘24h后称干重，测定肺组织湿重/干重比值。

1.7 Nrf2核蛋白表达水平检测 采用Western blot法。小鼠肺组织匀浆用全蛋白抽提检测试剂盒提取蛋白，Bradford法定量。取80μg蛋白进行凝胶电泳、转膜、封闭后，加入鼠抗人Nrf2单克隆抗体（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，次日TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000稀释）孵育后予以显色，使用凝胶成像分析系统G:BOXChemiXR5成像，Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析，以目的蛋白与内参β-actin的条带积分光密度值之比反映目的蛋白的表达水平。

1.8 肺组织中MPO、iNOS水平检测 按照试剂盒说明书，采用比色法检测MPO、iNOS水平。

1.9 血清TNF-α和IL-6水平检测 按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清TNF-α和IL-6水平。

1.10 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织形态学变化 ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组肺组织切片炎症反应显著，炎症细胞浸润肺泡间隔、肺泡腔，其中以中性粒细胞为主；支气管壁增厚，可见肺泡腔不规则扩大、肺泡间隔断裂。上述3组中又以Nrf2干扰组炎症反应最明显，而对照组未见上述炎症反应，见图1（插页）。与对照组比较，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组肺组织病理学损伤评分升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，Nrf2干扰组肺组织病理学损伤评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 4组小鼠肺组织病理学损伤评分比较（分）

2.2 4组小鼠肺组织湿重/干重比值比较 与对照组比较，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组肺组织湿重/干重比值升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，Nrf2干扰组肺组织湿重/干重比值升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

2.3 4组小鼠肺组织Nrf2核蛋白表达水平比较 与对照组比较，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组肺组织Nrf2核蛋白表达水平上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，Nrf2干扰组肺组织Nrf2核蛋白表达水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 4组小鼠肺组织湿重/干重比值比较

表3 4组小鼠肺组织Nrf 2核蛋白表达水平比较

2.4 4组小鼠肺组织MPO、iNOS水平比较 与对照组比较，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组肺组织MPO、iNOS水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，Nrf2干扰组肺组织MPO、iNOS水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 4组小鼠肺组织M PO、i NOS水平比较

2.5 4组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 与对照组比较，ALI组、干扰溶剂组和Nrf2干扰组血清IL-6、TNF-α水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与ALI组比较，Nrf2干扰组血清TNF-α、IL-6水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

3 讨论

内毒素诱发ALI在临床中十分常见，往往也是多器官功能障碍发生的启动原因。ALI一直是基础及临床研究中的重点及难点，总体临床救治效果仍不理想，死亡率较高。其发病机制尚未完全明确，有待进一步研究。本研究通过建立小鼠ALI模型，评价Nrf2对ALI的保护作用，以了解在ALI中Nrf2作为治疗靶点的可行性，为找到有效的治疗措施提供依据。

表5 4组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较（pg/m l）

临床上很多疾病都容易诱发内毒素相关性ALI。本研究采用腹腔注射LPS 10mg/kg建立小鼠ALI模型，结果表明ALI组、干扰溶剂组和Nrf2组于注射LPS 6h后肺损伤评分和肺组织湿重/干重比值均升高，提示ALI制备成功。

本研究显示LPS可增加肺组织Nrf2核蛋白表达，考虑与LPS能激活机体氧化应激系统有关。而此期间肺组织损伤程度加重，说明内源性免疫系统反应升高Nrf2以对抗损伤，但是此保护作用不足以对抗此期间炎症介质的致损伤作用，故最终结果仍然显示为肺脏损伤程度加重。本研究还发现，与ALI组比较，Nrf2干扰组肺组织Nrf2核蛋白表达水平下调，LPS诱导的小鼠ALI严重程度加重，血清促炎症因子水平和肺组织中氧化应激损伤指标升高。提示Nrf2对ALI的保护作用与其抗炎和抗氧化作用有关。

Nrf2是调节细胞内抗氧化物表达的关键性因子，具有维持细胞氧化-抗氧化平衡、抑制凋亡及抗炎的多重生物活性。Nrf2与胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）及ARE共同构成Keap1-Nrf2-ARE通路[5]。Nrf2主要在代谢性器官、解毒器官以及与外界相通的器官中高表达，如脑、肾、肺和肠等[8-9,12]。正常生理状态下，Nrf2定位于胞质，与Keap1形成复合物，并由Keap1促进Nrf2降解，使Nrf2维持在较低水平。当机体存在氧化应激反应时，Nrf2磷酸化并从Keap1蛋白上解离出来，随即活化转位进入细胞核结合到ARE上，启动其下游多个抗氧化基因及解毒酶等的转录翻译，来对抗氧化应激[5]。研究证实，经NRF2信号通路调控的保护性基因数量庞大，这些保护性基因包含抗氧化蛋白类基因、Ⅱ相解毒酶类基因和抗炎因子类基因等。其中抗氧化蛋白类基因是这些保护性基因中非常重要的一类，包括超氧化物歧化酶、血红素氧合酶1、依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶l等[13]。Nrf2可以抵抗炎症刺激，抑制细胞组织受到炎症损伤[8,14]。炎症标志物如IL-6、TNF-α等可用于炎症疾病患者预后的评估[15]。

Lyu等[16]发现基因敲除Nrf2可以加剧小鼠脓毒症器官损害程度，增加死亡率。Kim等[17]研究显示，相对于野生型小鼠，Nrf2敲除小鼠ALI的损伤程度更重，提示Nrf2信号通路是ALI保护的关键位点。郑丹等[18]发现全反式维甲酸阻断Nrf2-ARE通路可加重兔内毒素休克诱发的ALI。本研究显示，与ALI组比较，Nrf2干扰组肺损伤评分和肺组织湿重/干重比值升高，各氧化应激损伤指标升高，提示Nrf2的表达对ALI有保护作用。

综上所述，Nrf2通过抗炎和抗氧化功能对内毒素诱发小鼠ALI时的机体起到保护作用。