miR-4286与 AEG-1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

赵华 陈莹蓉 宋鹏涛 余才华 吴巍 马志红

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在世界范围内居各种恶性肿瘤之首[1]。肿瘤根据病理学类型可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌，其中NSCLC约占85%。近年研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在NSCLC的发生、发展、侵袭、转移等进程中起着重要的作用[2-4]。笔者在前期研究中应用miRNA芯片技术筛选NSCLC组织中差异表达的miRNA发现，miR-4286在NSCLC癌组织中的表达水平显著升高；进一步采用生物信息学方法进行数据挖掘发现，miR-4286与星形胶质细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）的启动子区域互补，miR-4286可能通过靶向AEG-1启动子序列以激活AEG-1的转录或翻译，共同参与NSCLC的发生、发展。本研究中笔者采用原位杂交方法和免疫组织化学染色分别检测miR-4286和AEG-1在140例NSCLC癌组织及配对癌旁正常组织中的表达，分析两者表达水平与NSCLC临床病理特征的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 人NSCLC组织芯片（芯片编号：HLug-Squ150CS01、HLugA150CS02）购自上海芯超生物科技有限公司。150例NSCLC患者样本来源于国家人类遗传资源共享服务平台（2005DKA21300），剔除信息不全及脱靶等因素，共入组患者140例，男105例，女35例；年龄 35～72（60.25±9.22）岁；肿瘤直径≤3cm 102 例，＞3cm 38例；腺癌72例，鳞癌68例；TNM分期：Ⅰ期59例，Ⅱ期45例，Ⅲ期27例，Ⅳ期9例；淋巴结转移59例，未转移81例；远处转移9例，未转移131例；肿瘤分化程度：Ⅰ期19例，Ⅱ期84例，Ⅲ期37例。所有患者均经临床确诊且术前未接受放、化疗，手术切除组织包含癌组织和相匹配的距离癌组织边缘5cm以上的癌旁正常组织。离体组织经常规4%甲醛固定并石蜡包埋，5μm厚度切片，制成直径1.5mm的组织芯片。

1.2 原位杂交方法 按照丹麦 Exiqon公司的原位杂交试剂盒 miRCURY LNATMmicroRNA ISH Optimization Kit（FFPE）（No.90008）的操作说明进行实验。组织芯片脱蜡水化后，蛋白酶 K（15μg/ml）37℃孵育 15min。将梯度乙醇脱水后的芯片置于55℃预杂交30min，接着加入90℃变性的地高辛标记探针miR-4286（丹麦Exiqon公司，YD00610917-BCG，1∶500）杂交工作液于 55℃孵育过夜。次日经过梯度洗片和封闭后，加入Anti-DIG-AP（美国 Roche 公司，No.11093274910，1∶800） 室温孵育1h。最后采用NBT/BCIP染色，核固红复染后封片镜检。用已知的阳性切片作阳性对照，用PBS替代探针作阴性对照。

1.3 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色参照文献[5]。大体步骤为石蜡切片脱蜡水化后，经3%H2O2封闭，高压法抗原修复，然后加入兔抗人单克隆抗体AEG-1（英国 Abcam 公司，ab124789，1∶300）4℃孵育过夜，次日辣根酶标记山羊抗兔IgG聚合物孵育30min，最后采用DAB染色，苏木素复染，镜像观察。

1.4 结果判断 miR-4286和AEG-1在NSCLC癌组织、癌旁正常组织中的阳性染色分别为红色至深紫色和淡黄色至棕褐色。对阳性染色肿瘤细胞比例和染色强度进行计分。阳性肿瘤细胞比例：无阳性肿瘤细胞计0分，≤25%计1分，26%～50%计2分，＞50%计3分。miR-4286与AEG-1的染色强度评分分别为：均无染色计0分，红色与淡黄色计1分（弱染色），紫色与棕黄色计2分（中等染色），深紫色与棕褐色计3分（强染色）。最终以阳性肿瘤细胞比例计分×染色强度计分表示miR-4286和AEG-1的表达水平，0～3分为低表达，4～9分为高表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织中miR-4286与AEG-1的表达 原位杂交结果显示，miR-4286阳性染色主要定位于NSCLC癌组织、癌旁正常组织的胞质或细胞核，着色为红色至深紫色，见图1（插页）。140例NSCLC癌组织中miR-4286高表达率为62.14%（87/140），高于癌旁正常组织的4.29%（6/140），差异有统计学意义（P＜0.01）。免疫组织化学检测结果显示，AEG-1阳性染色主要位于胞质、核膜和细胞连接处。在NSCLC癌组织中AEG-1中等染色，呈棕黄色；在癌旁正常组织中AEG-1染色缺失或弱染色，见图2（插页）。NSCLC癌组织中AEG-1高表达率为 55.71%（78/140），高于癌旁正常组织的7.86%（11/140），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 miR-4286和AEG-1表达与NSCLC临床病理特征的关系 miR-4286高表达与患者肿瘤直径大小、肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤组织类型、远处转移和肿瘤分化程度均无关（均P＞0.05）。AEG-1高表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤直径大小、肿瘤组织类型、远处转移和肿瘤分化程度均无关（均P＞0.05），见表1。

2.3 NSCLC癌组织中miR-4286与AEG-1表达的相关性分析 经Spearman等级相关分析，miR-4286的表达与 AEG-1的表达呈正相关（r=0.223，P=0.008），见表2。

表1 NSCLC癌组织中m i R-4286和AEG-1表达与NSCLC临床病理特征的关系（例）

表2 140例NSCLC癌组织中m i R-4286与AEG-1表达的关系（例）

3 讨论

miRNA具有广泛的基因调节功能，可通过对其靶基因的调控作用，参与多种生物学行为，如细胞生长、凋亡、分化、器官发育等，包括肿瘤的发生、发展[2-4]。最近有研究报道，miRNA也可通过与目的基因的启动子区域序列结合抑制阻遏子的表达，从而诱导目的基因的表达上调[6]。本研究中，笔者通过生物信息学方法发现miR-4286与AEG-1基因的启动子序列结合，并在NSCLC癌组织中观察到miR-4286与AEG-1的表达一致升高，通过Spearman等级相关分析发现NSCLC癌组织中miR-4286与AEG-1的表达呈正相关。

miR-4286是一个在人胚胎干细胞早期分化进程中筛选出的新发现的miRNA，在黑色素瘤、食管癌及直肠癌中可观察到miR-4286表达的上调[7-10]。本研究中，笔者采用原位杂交方法检测NSCLC组织中miR-4286的表达发现，miR-4286在NSCLC癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义。miR-4286的阳性染色定位于NSCLC癌组织、癌旁正常组织的胞质或细胞核，染色呈红色至深紫色。此外，miR-4286在NSCLC癌组织中的高表达与患者肿瘤直径大小、肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关。以上结果表明miR-4286在NSCLC的发病机制中发挥着重要作用，但具体作用机制有待进一步研究。

为研究NSCLC组织中miR-4286的表达上升是否与AEG-1的表达相关，笔者采用了免疫组织化学染色检测了相应组织芯片中AEG-1的蛋白表达。AEG-1是一个在HIV-I感染或TNF-α诱导的人胚胎星形细胞中表达上调的基因，其高表达被认为与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等密切相关[11-12]。本研究中，AEG-1在NSCLC癌组织中的高表达率显著高于癌旁正常组织，且其高表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关，该结果与笔者先前的报道相符[5]。此外，经Spearman等级相关分析显示NSCLC癌组织中miR-4286的表达与AEG-1的表达呈正相关，提示两者高表达共同参与了NSCLC的发生与转移。

综上所述，miR-4286与AEG-1在NSCLC的发生、发展中起重要作用，并协同参与了NSCLC的发生与转移等进程，抑制miR-4286或AEG-1的表达可望成为NSCLC靶向治疗的新途径。