栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路的影响

樊李明 张玉琴 王宏运 李煌 徐伟 褚克丹 林羽

摘要：目的 观察栝楼桂枝颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路的影响，探讨其作用机制。方法 采用线栓法致大脑中动脉栓塞建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型组和中药组，中药组给予栝楼桂枝颗粒药液灌胃，连续7 d。采用改良的神经功能缺损评分法进行大鼠神经功能评分，测定大鼠脑梗死面积，采用透射电镜观察大鼠海马神经元超微结构，RT-PCR检测大鼠脑组织钙活化调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、cAMP反应元件蛋白（CREB）的基因表达，Western blot检测大鼠缺血侧脑组织p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB和钙调蛋白（CaM）的蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损和脑梗死面积评分显著升高，海马神经元超微结构改变明显，细胞高度水肿、细胞核和细胞质收缩，p-CREB蛋白表达降低，CaM蛋白表达升高；与模型组比较，中药组大鼠神经功能评分和脑梗死面积显著降低，缺血区神经元超微结构改善，细胞损伤减少，p-CREB和p-CaMKⅡ蛋白表达升高，CaM蛋白表达降低。结论 栝樓桂枝颗粒能改善模型大鼠神经功能，抑制神经细胞凋亡，其作用机制可能与促进CREB、CaMKⅡ的磷酸化，抑制CaM的表达有关。

关键词：栝楼桂枝颗粒；脑缺血再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0057-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Gualou Guizhi Granules on Ca2+/CaMKⅡ/CREB signaling pathway in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury； To explore its possible mechanism of action. Methods A rat model of cerebral ischemia reperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion. SD rats were divided into sham-operation group， model group and TCM group. TCM group was given Gualou Guizhi Granules decoction for gavage for 7 d. The modified neural function defect scoring was used to score the nerve functions of rats and the area of cerebral infarction was determined. The ultrastructure of hippocampal neurons in rats was observed by transmission electron microscopy， and RT-PCR method was used to detect gene expressions of CaMKⅡ and CREB in the brain tissue. Western blot was used to detect the protein expressions of p-CREB， p-CaMKⅡ， CaMKⅡ， CREB and CaM in the ischemic brain tissue of rats. Results Compared with the sham-operation group， the nerve function defect and cerebral infarction area score of the model group increased significantly. Electron microscopy showed that the ultrastructural changes of hippocampal neurons were obvious， the cells were highly edematous， the nucleus and cytoplasm contracted， the protein expression of p-CREB decreased， and the protein expression of CaM increased. Compared with the model group， the nerve function score and the area of cerebral infarction of TCM group decreased significantly， ultrastructural neurons in ischemic area was improved， and cell damage was reduced， the protein expressions of p-CREB and CaMKⅡ increased， and the the protein expressions of CaM decreased. Conclusion Gualou Guizhi Granules can improve the neural functions of model rats and inhibit the apoptosis of nerve cells. Its mechanism of action may be related to the phosphorylation of CREB and CaMKⅡ and the inhibition of the expression of CaM.

Keywords： Gualou Guizhi Granules； cerebral ischemia reperfusion injury； apoptosis； rats

缺血性腦卒中是严重威胁人类身体健康的常见疾病之一，其致病原因复杂多样。细胞凋亡是脑缺血损伤的最关键环节，并且发挥着重要作用。在各种类型的脑缺血过程中，细胞凋亡都是神经元死亡的重要形式。目前研究表明，由缺氧、缺血造成的脑部损伤可引起兴奋性神经递质的过度释放，从而使突触后膜处于一种持续性去极化状态，造成大量钙离子内流，引发细胞内一系列钙离子的生化反应，导致神经元凋亡[1-5]。钙离子信号通路在细胞存活、增殖、代谢中起到至关重要的作用，其作用机制为Ca2+进入细胞内，与钙调蛋白（CaM）结合形成Ca2+-CaM，活化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）。磷酸化的CaMKⅡ可直接活化cAMP反应元件蛋白（CREB），进一步调节细胞骨架蛋白和突触蛋白合成，CREB通过磷酸化激活下游抗凋亡蛋白减弱神经元凋亡，促进神经元形成[6]。

栝蒌桂枝汤源于《金匮要略》，有滋养津液、解肌祛邪、舒缓筋脉功效。栝楼桂枝颗粒为福建省第二人民医院院内制剂，其汤剂临床使用治疗脑卒中后痉挛性偏瘫，收效良好[7-8]。课题组前期研究发现，栝楼桂枝颗粒能抑制神经元凋亡及兴奋性氨基酸（谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸）的释放，对缺血性脑卒中有不同程度的疗效[9-12]，但其具体机制尚不清楚。因此，本实验采用线栓法致大脑中动脉栓塞（MCAO）建立大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，观察栝楼桂枝颗粒对模型大鼠Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路相关因子蛋白和mRNA表达的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性健康SD大鼠54只，SPF级，体质量240～280 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（55±5）%环境，自由摄食饮水。

1.2 药物和试剂

栝楼桂枝颗粒，福建省第二人民医院药学部提供，批号20160809。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，美国Sigma Aldrich），生理盐水（福州海王福药制药有限公司），水合氯醛（麦克林，C804539），多聚甲醛（国药集团，20160428），Trizol（Life technologies，15596026），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，P0012s），p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB及β-actin抗体（CST公司），Revert Aid First strand cDNA Synthsis Kit（Thermo Scientific，K1622），Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，4367659）。

1.3 仪器

数码相机（日本佳能公司，IXUS130），MODE MED 6数字医学图像分析系统（加拿大MICTICES仪器公司），H-7500透射电子显微镜、凝胶成像分析系统、PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司），实时荧光定量PCR仪（AppLied Biosystems）。

1.4 造模

将54只大鼠随机分为假手术组（18只）、模型组（36只），参照前期造模方法[11-12]实行大鼠左侧大脑中动脉阻塞手术，建立大鼠MCAO模型。

1.5 分组和给药

将神经功能评分为1～3分的造模组大鼠随机分为模型组（18只）和中药组（18只），假手术组和模型组灌胃给予生理盐水，根据人体与动物药物等效剂量换算，中药组灌胃给予3.6 g/（kg·d）栝楼桂枝颗粒。各组于造模后2 h给药，给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续7 d。

1.6 神经功能评分

根据分级评分系统对大鼠进行神经缺陷评估，分数越高表明大鼠神经功能损伤越严重。0分：大鼠行为正常，无神经功能障碍；1分：大鼠在提起尾部和悬吊时左前肢无法完全伸直；2分：大鼠在爬行时向左跌倒；3分：大鼠无法独立行走；4分：大鼠无神经意识[11-12]。

1.7 脑梗死面积测定

大鼠经神经系统评估后，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）麻醉，断头法快速取出大脑。取脑组织，-20 ℃冷冻10 min，保持切片前形态完整。大脑切片（厚2 mm），放入0.2%TTC染色剂中，37 ℃烘箱避光孵育1 h。孵育结束后用高分辨率数码相机拍摄图像并分析。使用医学图像分析系统计算梗死面积，以梗死面积的百分比评估脑梗死程度。梗死面积百分比（%）=（非梗死侧半球面积-梗死侧半球正常脑组织面积）÷非梗死侧半球面积×100%。

1.8 透射电镜观察神经元超微结构

每组随机选取3只大鼠，10%水合氯醛溶液麻醉，断头，低温取出脑组织，分离出缺血区后固定于固定液中，利用H-7500透射电子显微镜进行图像采集，观察缺血区神经元超微结构变化。

1.9 RT-PCR检测脑组织钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反应元件蛋白的mRNA表达

每组大鼠取脑组织100 mg，加Trizol试剂1 mL后匀浆，提取总RNA。测定RNA浓度，-80 ℃保存。采用Revert Aid First strand cDNA Synthsis Kit进行反转录，各目的基因的扩增引物序列见表1。反应在荧光定量PCR仪上进行，扩增条件：50 ℃预热2 min，95 ℃预热10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸 30 s，共40个循环；采用ABI 7900荧光定量PCR仪软件进行数据分析，计算目的基因相对表达量。

1.10 Western blot检测脑组织p-cAMP反应元件蛋白、p-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、钙活化调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反应元件蛋白和钙调蛋白的蛋白表达

大鼠断头取脑后制成匀浆，严格按照蛋白提取试剂盒说明书进行操作，提取脑组织全蛋白，测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶分离蛋白，经PVDF膜转膜，再用脱脂牛奶封闭2 h。分别加p-CREB、p-CaMKⅡ、CREB、CaMKⅡ抗体（1∶1000）及CaM抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10 min，洗涤后加入经HRP标记的羊抗兔二抗（1∶5000），孵育2 h，再用TBST液洗涤3次×10 min。完毕后条带经Bio-RAD凝胶分析仪进行图像扫描分析，灰度值用Quantity One测定。分别用p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB与β-actin灰度值的比值表示p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB和CaM蛋白相对表达量。

1.11 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能评分结果

假手术组大鼠无神经功能缺损，行为正常；与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠神经功能评分明显降低（P<0.01）。结果见图1。

2.2 栝楼桂枝颗粒对模型大鼠脑梗死面积的影响

TTC染色后，梗死区域呈白色，非梗死区域呈红色。中药组大鼠梗死面积明显小于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2。

2.3 栝楼桂枝颗粒对模型大鼠脑组织细胞超微结构的影响

假手术组神经元形态清晰，核仁清晰，结构完整；模型组海马神经元超微结构改变明显，表现为细胞高度水肿、细胞核和细胞质收缩，线粒体嵴部分崩解，广泛肿胀的粗面内质网普遍存在；中药组水肿明显减轻，线粒体嵴和膜较为清晰，发生凋亡坏死的细胞明显减少。结果见图3、图4。表明栝楼桂枝颗粒可保护细胞器的形态，减少细胞的损伤。

2.4 栝楼桂枝颗粒对模型大鼠脑组织钙活化调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反应元件蛋白mRNA表達的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织CREB mRNA表达明显降低，CaMKⅡ表达显著增加，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠脑组织CREB水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。见图5。

2.5 栝楼桂枝颗粒对模型大鼠脑组织p-cAMP反应元件蛋白、p-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、钙活化调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、cAMP反应元件蛋白和钙调蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织p-CREB蛋白表达明显降低，CaM蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药组大鼠脑组织p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ和CREB蛋白表达明显升高，CaM蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图6、图7。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的级联反应，如谷氨酸释放、钙超载和炎症反应等，缺血再灌注后会使神经细胞产生快速的级联反应损伤，缺血组织病理损害进一步加重，最终诱发神经元凋亡或坏死。有文献报道，脑缺血再灌注损伤后Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路起着至关重要的作用[13-14]。

Ca2+超载引发的损伤发生在脑缺血再灌注损伤全过程，且参与自由基、兴奋性氨基酸等所致的损伤过程[15]。Ca2+作为体内重要的第二信使，参与机体内多种活动如细胞正常生理功能维持、细胞增殖与分化和神经递质的分泌与神经调节等[16]。Ca2+内流导致神经元内Ca2+浓度升高，激活各种Ca2+依赖性酶（如CaMKⅡ、钙调神经磷酸酶）和Ca2+结合蛋白。缺血损伤诱导的Ca2+超载可能过度激活Ca2+/CaM依赖性通路，导致不可逆的细胞损伤。细胞内的Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合体，进而活化Ca2+/CaMKⅡ。CaMKⅡ是脑内含量最丰富的蛋白激酶，磷酸化的CaMKⅡ可直接活化CREB，也可通过络氨酸激酶，使ras处于ras-GTP活化状态，进而启动ras-raf-MEK- ERK联级反应，pERK可转入核内与CREB结合，激活Ser133位点。p-CREB进一步调节细胞骨架蛋白和突触蛋白的合成，促进神经元的形成[17-18]。

本实验结果显示，与模型组比较，中药组神经功能评分和梗死面积显著降低（P<0.01）；电镜观察发现，与模型组比较，栝楼桂枝颗粒可改善大鼠缺血半暗带的超微结构。此外，栝楼桂枝颗粒显著增加p-CREB和p-CaMKⅡ的表达，降低CAM的表达。

综上所述，栝楼桂枝颗粒可改善MCAO大鼠神经功能，抑制神经细胞凋亡，其作用机制可能是通过激活Ca2+/CaMKⅡ/CREB信号通路，促进CREB、CaMKⅡ的磷酸化，抑制CaM的表达，从而抑制MCAO大鼠神经元凋亡。

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