甲基糠基二硫醚对沙门氏菌毒力基因表达的影响

吴 虹 燕， 魏 丽 娜， 李 鑫 鑫， 杨 春 雪， 侯 红 漫， 张 公 亮

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

引发人畜共患病的沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌，属于革兰氏阴性细菌[1]。基于其脂多糖(LPS)中侧链多糖(O-抗原)和鞭毛蛋白(H-抗原)种类的不同，可分为2 579种血清型[2]，绝大多数血清型能在人和动物间交叉感染，引发人和动物败血症、胃肠炎和腹泻等症状[3]。流行病学研究表明，在美国，每年沙门氏菌感染案例高达4万例[2]；在我国，由感染沙门氏菌引起的细菌性食物中毒事件也不占少数[4]。

随着现代分子生物学技术的纵向发展和横向广泛应用，越来越多的研究表明沙门氏菌的致病性是大量毒力因子如毒力岛、毒力质粒携带的spv操纵子、黏附素、鞭毛等相互作用的结果[5-6]。毒力岛1(SPI-1)遗传性状稳定，几乎存在于所有沙门氏菌血清型中，负责编码与细菌致病性有关的Ⅲ型分泌系统1(T3SS-1)，分泌性效应蛋白和调节蛋白[7]。位于SPI-1上的调节蛋白HilA能够激活编码T3SS-1的所有操纵子，因而在沙门氏菌感染的初始阶段起着重要作用[8]。HilA的表达受SPI-1内的HilC和HilD，以及在另一独立岛内的RtsA联合作用所控制，这三者都可以与hilA启动子相连以诱导其表达[9]。

长期以来，抗生素的滥用所造成的安全问题层出不穷，沙门氏菌耐药基因的水平转移和多重耐药菌株的出现，给人类和动物的健康带来了极大的威胁[10]。结合消费者对食品色香味和营养性的诉求，天然来源的抑菌剂如植物素、植物提取物、次级代谢产物的相关研究引起了广泛的关注[11]。含硫香料作为天然食品添加剂的一种，凭借香味浓郁、阈值低等特点广泛应用于食品生产加工中[12]。其中，硫醚类香料不仅因具备特殊的气味而在丰富食品风味方面发挥着重要的作用，也因某些含氧官能团的存在而展现出了一些生理活性功能[13]。Kiesel等[14]探究了二烯丙基三硫醚(diallyl trisulfide，DATS)对乳腺癌细胞生长的影响，结果表明DATS可以作为一种预防乳腺癌细胞的生物活性物，阻止切口通路组分在癌细胞中的过度表达。孟君等[15]研究发现，新鲜的大蒜提取液能够有效抑制几种常见食源性致病菌的生长，进一步的研究发现具有抑菌活性的主要成分为二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)和DATS。本课题组前期的研究结果也证明了硫醚类香料对常见食源性致病菌有较好的抑制效果[16]。目前，考察含硫香料对致病菌毒力基因调控作用的相关研究并不多见，有待补充完善。本研究选取常见硫醚类香料中的甲基糠基二硫醚(methyl furfuryl disulfide，MFDS)为原料，在基因水平上，利用实时荧光定量PCR技术探究其对沙门氏菌毒力基因(hilA、hilC、hilD)表达情况的影响，为探索沙门氏菌的毒力机制提供理论支持，同时为天然来源抑菌剂在食品领域的开发奠定理论基础。

1 实 验

1.1 材料与仪器

硫醚类香料MFDS选自GB 2760—2014，香料与提取制造协会(FEMA)编号为3362，美国Sigma公司。沙门氏菌ATCC 14028，中国普通微生物菌种保藏管理中心，使用前在含40%甘油的冻存管中于-80 ℃保存。

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水解酪蛋白、无水乙醇、琼脂粉，均为国产分析纯，博诺试剂公司；RNase-free water、DEPC水、实时荧光定量PCR引物对，生工生物工程股份有限公司；细菌总RNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；反转录除杂试剂盒，宝生物工程有限公司。

UV-1750型紫外分光光度计，日本岛津仪器有限公司；MyiQTM2型荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；Spectra Max M2酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制与菌株活化

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，去离子水定容至100 mL，pH调至7.0左右。

取冻存菌株活化培养2次，转接至液体培养基中，37 ℃下150 r/min过夜培养，备用。

1.2.2 最低抑菌浓度的测定

参照Miladi等[17]的方法，采用微量肉汤稀释法测定MFDS对沙门氏菌作用的最低抑菌浓度(MIC)。用二甲基亚砜(DMSO)将MFDS原液配成初始浓度为8 mmol/L的储备液，水解酪蛋白肉汤进一步将其稀释为不同浓度的工作液添加至96孔板中，并添加相同浓度的菌液。以MHB作阴性对照，含菌液稀释液的MHB为生长对照孔，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，每3 h测定一次OD600。

1.2.3 MFDS作用下沙门氏菌生长曲线的测定

将菌液培养至浓度约108CFU/mL时，吸取1 mL于99 mL液体培养基中，分别添加40 μL不同浓度的MFDS，以添加等体积的DMSO作为对照组。37 ℃下150 r/min摇床培养12 h，每隔3 h利用紫外分光光度计测定OD600。以时间(t)为横坐标，OD600为纵坐标，绘制MFDS作用后沙门氏菌的生长曲线。

1.2.4 沙门氏菌总RNA提取及质量检测

向沙门氏菌培养液中添加不同亚抑菌浓度的MFDS，以未添加MFDS的作为对照组，于37 ℃下150 r/min振荡培养12 h。吸取1 mL菌液于12 000 r/min下4 ℃离心2 min，获得菌体。后续操作按照细菌总RNA提取试剂盒说明书进行，使用酶标仪检测RNA的纯度及浓度。

1.2.5 qRT-PCR法探究MFDS对沙门氏菌毒力基因表达的影响

将提取到的质量合格的沙门氏菌总RNA进行纯化处理，再反转录成cDNA并以其为模板，以沙门氏菌主要毒力基因hilA、hilC、hilD为靶基因，16S rRNA为内参基因进行qRT-PCR。所用的荧光引物对由生工生物工程有限公司合成，引物对序列见表1。

qRT-PCR过程的反应参数：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；63.3 ℃，25 s；72 ℃，15 s。于80 ℃处停留15 s，收集荧光信号，反应40个循环，并在60～95 ℃范围建立熔解曲线。根据所得到的循环数，参照Vikram等[18]的方法计算和分析目的基因的相对表达量。

表1 实验所用引物

1.2.6 统计学分析

使用DPS数据分析软件进行显著性分析，P<0.01具有极显著差异性。

2 结果与讨论

2.1 MFDS对沙门氏菌的最低抑菌浓度

由表2可以看出，当MFDS浓度高于2 mmol/L 时，沙门氏菌在96孔板内的生长情况均受到抑制；而当其终浓度稀释至1 mmol/L时，沙门氏菌开始出现生长，因此MFDS对沙门氏菌的MIC为2 mmol/L。

表2 MFDS对沙门氏菌作用的最低抑菌浓度

2.2 MFDS对沙门氏菌生长曲线的影响

加入不同浓度的MFDS后，沙门氏菌的生长情况如图1所示。在MIC下，沙门氏菌的生长受到较为明显地抑制；在1/2 MIC，与对照组相比，MFDS抑制了约一半的沙门氏菌生长。MFDS浓度在1/4～1/32 MIC，OD600与对照组差距很小，表明其对沙门氏菌的生长不再有明显的抑制效果。因此，MFDS对沙门氏菌的抑制作用具有浓度依赖性，1/4、1/8、1/16和1/32 MIC可作为不影响沙门氏菌生长的亚抑菌浓度应用于后续研究。

图1 MFDS对沙门氏菌的生长的影响

2.3 沙门氏菌总RNA的提取及质量检测

经酶标仪检测，提取得到的RNA样品质量浓度分别为355.78、276.55、410.22、285.46、295.66 ng/μL。OD260/OD280分别为1.97、2.01、2.09、1.95、2.01，符合浓度及纯度要求。图2为不同浓度MFDS作用沙门氏菌后RNA提取的电泳结果，如图2所示，总RNA提取效果良好，降解程度小，完整度高，可用于下步研究。

2.4 沙门氏菌毒力基因及内参基因引物对的特异性

各亚抑菌浓度的MFDS与沙门氏菌培养12 h 后，提取实验组和对照组的总RNA并将其反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR，得到熔解曲线，如图3所示。Tm含义说明：每种基因设置了3个平行实验组，当各基因3个平行结果的峰值落在同一Tm处，说明qRT-PCR过程中未出现非特异性扩增，表明所用引物对特异性良好。图3(a)左侧各组为hilA基因，Tm均在80 ℃；右侧各组为内参基因16S rRNA，Tm均在86 ℃。图3(b)左侧各组为hilD基因，Tm均在83.5 ℃；右侧各组为hilC基因，Tm均在84.5 ℃。各组基因的熔解曲线均呈现单一峰，表明所用引物对的特异性良好，可用于后续qRT-PCR检测。

M，Marker；1，1/4 MIC；2，1/8 MIC；3，1/16 MIC；4，1/32 MIC；5，空白对照

图2 不同浓度MFDS作用沙门氏菌后RNA提取的电泳结果

Fig.2 Electrophoretogram of RNA extraction fromSalmonellaat different MFDS concentrations

(a) 毒力基因hilA和内参基因16S rRNA

(b) 毒力基因hilD和毒力基因hilC

图3 qRT-PCR法引物验证的熔融曲线

Fig.3 The melting curves of qRT-PCR primers

2.5 MFDS对沙门氏菌毒力基因表达的影响

如表3所示，沙门氏菌与不同浓度MFDS共培养12 h后，3种毒力基因hilA、hilC、hilD的表达量呈剂量依赖性下调。经1/32 MIC的MFDS作用后，与对照组相比，3种基因表达量的变化无显著性差异。当浓度高于1/16 MIC，与对照组相比，三者的表达表达水平显著降低(P<0.01)，表达量分别为对照组的64.82%、63.34%和68.35%。特别是当MFDS浓度增大到1/4 MIC时，hilA、hilC、hilD的表达量均下调了约215%，为对照组的46.76%。结果表明，MFDS呈剂量依赖性抑制毒力基因hilA、hilC、hilD的表达。

表3 不同浓度MFDS对沙门氏菌毒力基因表达量的影响

Tab.3 Effects of different concentrations of methyl furfuryl disulfide on the expression of virulence genes inSalmonella

基因c(MFDS)/MIC相对表达量/%hilA对照100.001/3294.33a±2.731/1664.82b±4.201/857.23bc±3.031/450.70c±5.71hilC对照100.001/3295.37a±4.021/1663.34b±2.241/854.10bc±4.941/447.44c±4.23hilD对照100.001/3292.89a±2.471/1668.35b±2.211/851.84c±2.261/442.13d±2.77注:字母a、b、c代表数据显著性分析结果,不同字母表示与对照组比较差异极显著(P<0.01)。

3 结 论

在96孔培养体系下测定MFDS对沙门氏菌作用的MIC为2 mmol/L。进一步考察了不同浓度的MFDS对沙门氏菌生长曲线影响的结果显示：MFDS在MIC下对沙门氏菌的生长有明显的抑制作用；在1/2 MIC，细菌的生长曲线处于较低状态；1/4～1/32 MIC，MFDS对沙门氏菌的生长不再有明显地抑制效果。qRT-PCR法研究结果表明，1/4、1/8、1/16、1/32 MIC亚抑菌浓度下的MFDS以浓度依赖性的方式下调沙门氏菌毒力基因(hilA、hilC、hilD)的表达水平。且当MFDS的添加浓度高于1/16 MIC时，与对照组相比，毒力基因hilA、hilC、hilD的表达水平均呈极显著性降低(P<0.01)。