血清外泌体miRNA-193b诊断阿尔茨海默病的价值

刘辰庚 杨婷婷 王培昌

首都医科大学宣武医院检验科（北京100053）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是老年人中最常见的进行性神经退行性疾病。其病理改变主要表现为脑内细胞外β淀粉样蛋白（Aβ）和细胞内磷酸化tau蛋白的大量沉积。轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）被认为是AD发病的前驱阶段，主要表现为记忆力、注意力、语言和视空间等认知功能不同程度的轻度下降。主观认知障碍（subjective cognitive decline，SCD）被认为是AD的临床前期阶段，表现为患者主诉记忆力下降，而认知评估却表现为正常水平。痴呆期（dementia of Alzheimer′s type，DAT）是阿尔茨海默病晚期阶段，表现为智力严重衰退，严重影响患者日常生活能力，对家庭和社会造成沉重的负担［1］。因此，探索AD发病前期阶段（前驱期和临床前期）大脑生物标志物改变将有助于对其进行早期干预、早期治疗，从而延缓病情的进展［2］。

本实验室前期细胞实验的结果表明miR-193b能通过与APP mRNA的3′-UTR结合使其降解从而抑制APP的蛋白表达，同时Aβ42能降低miR-193b的表达［3］。之后提取MCI和DAT患者CSF和血清的外泌体并检测其中miR-193b的含量，发现外泌体内miR-193b在MCI患者的血清中较对照组显著降低，且DAT患者血清外泌体内miR-193b低于MCI患者。血清外泌体miR-193b可能为AD，特别是早期诊断AD的标志物［4］。但是目前本课题组进行的MCI和DAT患者血清外泌体miR-193b检测尚属小样本研究，而且没有纳入SCD患者，因此本研究旨在通过大样本检测SCD、MCI、DAT患者血清外泌体miR193b的表达水平，进一步探索血清外泌体miR193b作为AD的早期诊断标志物的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料随机选取2015年9月至2016年8月就诊于首都医科大学宣武医院SCD患者30例，其中男11例，女19例，平均年龄（61.66±5.43）岁。MCI患者69例，其中男30例，女39例，平均年龄（66.14±7.61）岁。DAT患者73例，其中男30例，女43例，平均年龄（74.12±8.19）岁。SCD患者诊断符合pre-MCI之主观认知障碍研究标准［5］。MCI和DAT疾病诊断符合美国国立卫生研究院国立老化研究所和阿尔茨海默病协会于2011年4月联合发布，并经我国神经内科学会推荐的诊断标准［6］。另选同期性别和年龄基本一致的非痴呆对照人群75例（健康对照组），其中男36例，女39例，平均年龄（67.34±6.56）岁，该组人群基本健康，无脑梗死、脑出血、冠心病、脑外伤等病史；受试者或其家属均签署书面知情同意书，并经本院伦理委员会批准立项。

1.2主要仪器及试剂日立HT7700透射电子显微镜（日本日立高新技术公司）罗氏480定量PCR系统（德国Roche公司）；化学发光成像系统（美国ProteinSimple公司）；Total exosome isolation reagent（from serum）试剂盒（Invitrogen）；血清miRNA提取分离试剂盒（天根生化科技有限公司）；miRNA第一链cDNA合成（加尾法）；miRNA荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green Ι染料法）（上海生工生物有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；抗Alix、CD63单克隆抗体（美国SBI公司）。

1.3方法

1.3.1标本采集受试者于空腹12 h后用促凝管采集外周静脉血5～10 mL，勿颠倒混匀；室温静置30 min后，4℃、4 000 r/min离心10 min，取上层淡黄色血清，于冰上分装成500 μL于1.5 mL EP管后置于-80℃冰箱备用。以上过程保证在2～3 h完成。

1.3.2血清外泌体的提取按照invitrogen公司total exosome isolation（from serum）外泌体提取试剂盒说明书进行。

1.3.3透射电镜鉴定血清外泌体形态取15～20 μL外泌体样品悬液滴于帕拉胶上，并覆盖铜网，室温静置5 min。用滤纸从侧面吸去多余的液体，滴加20 g/L的磷钨酸，室温复染5 min。在65℃白炽灯下烤15 min。透射电镜下观察、拍照。

1.3.4Westrn blot检测外泌体标记蛋白将提取的外泌体总蛋白及血细胞蛋白经BCA试剂盒进行蛋白定量，12%SDS-PAGE胶电泳分离，转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，漂洗5 min，加入按1∶1 000比例稀释的兔抗人CD63、Alix单克隆抗体，室温孵育1.5 h后4℃过夜。二抗室温避光孵育120 min，均匀滴上ECL超敏化学发光液，进行曝光拍照。

1.3.5血清外泌体内miR-193b的提取及测定PCR反应检测血清中miR-193b水平：测量以试剂盒法提取外泌体总miRNA，测定浓度后进行逆转录反应，20 μL逆转录反应体系中含2×miRNA RT Solution mix 10 μ L，miRNA RT Enzyme mix 2 μL，micro RNA100 ng。20 μL PCR反应体系中含2×miRNA qPCR master mix10 μL，Template DNA 2 μL，相应上、下游引物各 0.5 μL。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40个循环。引物序列见表1，以U6 sn RNA为内参，使用2-ΔΔCt法［7］计算并统计miR-193b组间表达的差异。

表1 PCR上游引物序列Tab.1 The sequence of PCR forward primers

1.4统计学方法采用2-△△Ct法计算miR-193b的相对表达量，使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，用MedCalc software、GraphPad Prism软件进行作图。应用K-S检验对数据进行正态性检验；计量资料以均数±标准差（）表示；不同组之间miRNA的表达差异采用Mann-Whitney非参数检验法进行统计分析采用分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。通过利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲线下面积（the area under the ROC curve，AUC）来评价miR-193b对AD的早期诊断价值，曲线下面积的比较采用Z检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清中外泌体的分离鉴定首先，应用纳米粒子跟踪分析（NTA）观察外泌体样品粒径分布及颗粒浓度。如图1A所示，颗粒直径呈单峰正态分布曲线，颗粒主要分布于30～200 nm之间。样品中颗粒分散均一。透射电镜鉴定外泌体形态，电镜内可见直径约为100 nm，圆形具有脂质双层膜囊状的颗粒见图1B。蛋白免疫印迹（Western blot）检测外泌体标志性蛋白分子的表达情况，表明提取的外泌体均表达Alix，CD63标志性蛋白分子见图1C；以上结果表明，样品具有已报道的外泌体的特性。纯化的样品中含有大量外泌体颗粒。

2.2各组血清外泌体miR-193b表达水平变化

健康对照组、SCD、MCI及DAT患者4组血清外泌体miR-193b的表达水平如图2A所示。4组间两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；SCD、MCI和DAT患者血清外泌体内miR-193b水平均低于对照组，且DAT组低于MCI组，MCI组低于SCD组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3血清外泌体miR-193b对SCD的诊断价值检测血清外泌体miR-193b用于诊断SCD时，AUC为0.947（95%CI：0.886 ～ 0.981），具有一定诊断价值。其诊断临界值为1.83时，特异度为94.7%，灵敏度为83.3%。见图2B。

图1 外泌体的分离鉴定结果Fig.1 Isolation and identification results of exosomes

图2 血清外泌体miR-193b在阿尔茨海默病患者中的检测分析Fig.2 Detection and analysis of serum exosome miR-193b in patients with Alzheimer′s disease

3 讨论

近年来利用各种生物标志物来探测脑内AD相关的病理及特征性改变，使得AD的诊断阶段不断提前，2014年主观认知下降概念启动组（subjective cognitive decline initiative，SCD-Ⅰ）提出的AD临床前期的SCD概念框架，特别提出伴有ApoE ε4等位基因、AD病理相关的生物标志物阳性等条件可以增加其作为AD临床前期的特异性［5］。因此，继续深入研究AD相关诊断标志物，有助于临床诊断极早期AD，为AD的早期干预及治疗提供更宽的时间窗。

研究发现miR在细胞内具有多种重要的调节作用。HEBERT等［8］发现，在早期AD患者皮质中miR-107的表达显著下降，进一步实验表明，在AD的发展过程中，当miR-107表达降低时，BACE1蛋白水平增加，所以HEBERT等［8］推论miR-107可能通过调节BACE1基因的表达从而加速AD的进展。KHOO等［9］对AD患者及对照的大脑皮质区进行miRNA分析，检测到13种miRNA在AD脑内的表达显著降低，数据分析后发现7种miRNA的靶基因可能参与了AD病程，如miR-9、miR-15a、miR-19b和miR-29b-l均在BACE1基因的3′UTR 存在相应的结合位点；而 let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b在APP基因的3′UTR存在结合位点。虽然大多数miRNA在细胞内发现，但越来越多的证据表明miRNA也存在于细胞外的体液中，如血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液等［10-12］，特别是外周血miR对疾病的诊断和治疗监测具有较大的潜在价值。MiRNA在细胞外的存在形式主要有3种：包裹于外泌体等膜囊泡中、与高密度脂蛋白结合以及与AGO2蛋白结合，这三种形式可避免细胞外miRNA被内源性核糖核酸酶降解，保证其稳定性［13-15］。而外泌体miRNA被认为是在分泌细胞的支配下主动转运特定的miR，虽来源于细胞，却与来源细胞存在差异，并且其表达水平可随生理条件的不同而改变，更能真实体现疾病的状态，近年来颇受关注，逐渐成为了研究热点。

本研究选择了血清外泌体作为miRNA的来源，纳入就诊于本院的认知障碍患者212例。通过Western blot检测发现，外泌体中稳定表达CD 63和Alix标志性蛋白分子，并通过电镜观察证实了提取物为血清来源的外泌体，与文献报道的类似。以纯化的外泌体提取总RNA，通过qRT-PCR分别检测认知障碍患者和健康体检人外泌体miR-193b水平，结果显示，SCD、MCI和DAT患者血清外泌体内miR-193b水平均低于健康对照组，且DAT组低于MCI组，MCI组低于SCD组，差异有统计学意义（P＜0.05）。诊断试验提示血清外泌体miR-193b对SCD具有一定的诊断价值。此结果表明血清外泌体miR-193b可能成为AD早期诊断的有效检测手段，具有一定的推广应用前景。但本研究为单中心的临床研究，其结果尚需大规模、多中心的临床研究证实，从而进一步探索血清外泌体miR-193b作为AD早期诊断标志物的意义。