STAT3和STAT4基因单核苷酸多态性与肝细胞癌的相关性

范敬静 常彩芳 王浩

河北北方学院附属第一医院感染科（河北张家口075000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率分别位居恶性肿瘤第五位和第三位［1］。全球范围内每年新发HCC病例约63万例，其中超过一半发生在中国［4］。信号转导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和信号转导与转录激活因子4（signal transducers and activators of transcription 4，STAT4）在肝癌细胞生长、凋亡调控过程中均发挥重要作用［3-4］。近年研究发现STAT3基因rs2293152位点和STAT4基因rs7574865位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）可影响个体 HCC 的遗传易感性［5-8］。但rs2293152、rs7574865位点SNPs与环境因素在HCC发病中是否存在交互作用，目前国内外鲜有报道。本研究拟采用病例对照研究方法，探究rs2293152、rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性的关联及与环境因素的交互作用，以期为HCC防治提供参考依据。

1 对象与方法

1.1研究对象经医院医学伦理委员会批准，采用以医院为基础1∶1配比病例对照研究方法，选取2013年1月至2017年12月于河北北方学院附属第一医院诊治的经肝组织病理切片确诊的新发HCC患者256例作为观察组。依据性别、年龄（±3岁）与观察组病例进行频数匹配的原则，选取同期在河北北方学院附属第一医院体检的健康人群256例作为对照组。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2DNA提取和SNPs检测采集所有研究对象空腹外周静脉血5 mL，DNA提取使用血液基因组柱式提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）。SNPs检测使用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术。PCR扩增引物：STAT3基因rs2293152位点正向引物序列 5′-TCCCCTGTGATTCAGATCCC-3′、反向引物序列 5′-CATTCCCACATCTCTGCTCC-3′；STAT4基因rs7574865位点正向引物序列5′-AAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTG-3′、反向引物序列 5′-CCACTGAAATAAGATAACCACTGT-3′。PCR 反应体系包括：模板DNA 100 ng，正向、反向引物各0.5 μmol，MgCl21.5 mmol，Taq DNA聚合酶0.65 U，dNTP 0.2 mmol，总反应体系为25 μL。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸5 min。对rs2293152、rs7574865位点的PCR产物分别加入HpaII和HpaI内切酶。产物使用3%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外分析仪下观察并记录结果，同时从研究的DNA样本随机抽取5%进行重检，以确保检测结果的准确性。

1.3资料收集根据相关文献资料，由经过统一培训的研究人员收集所有研究对象的一般人口学信息及HCC环境危险因素，包括年龄、性别、吸烟、饮酒、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染及HCC家族史。吸烟定义为累积吸烟＞100支或超过3年每周至少1 d以上（＞15 min/d）吸入香烟燃烧所产生的烟雾［9］；饮酒定义为连续或累积饮酒时间超过6个月，平均每日摄入酒精量≥50 g，酒精摄入量＝酒精度×摄入体积×0.8；HCC家族史定义为研究对象的一级、二级或三级亲属中有HCC患者［10］。

1.4统计学方法应用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。计量资料以表示，组间比较采用Student'st检验；计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。采用Haploview 4.2软件检验基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡。采用二分类Logistic回归模型分析rs2293152、rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性的关联及与环境因素间的交互作用，以比值比（odds ratio，OR）及95%置信区间（confidence interval，CI）来表示关联强度，检验水准α＝0.05。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组间一般资料比较两组在年龄、性别构成方面，差异无统计学意义（P＞0.05）；而在吸烟、饮酒、HBV感染及HCC家族史方面，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2两组间rs2293152、rs7574865位点基因型分布比较两组rs2293152、rs7574865位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（rs2293152：χ2＝0.432，P＝0.511；rs7574865：χ2＝0.112，P＝0.737），具有群体代表意义。两组间rs2293152、rs7574865位点基因型分布差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 两组间一般资料比较Tab.1 Distributions of general clinical characteristics in the two groups 例（%）

表2 两组间rs2293152、rs7574865位点基因型分布比较Tab.2 Genotypes frequency distribution of rs2293152，rs7574865 between the two groups 例（%）

2.3rs2293152、rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性关联分析经二分类Logistic回归模型校正年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV感染、HCC家族史后发现，与rs2293152位点CC基因型相比，GG型可显著增加HCC的发病风险（OR＝1.682，95%CI：1.206～3.445，P＝0.031）；与GC+CC基因型相比，GG型亦可显著增加HCC的发病风险（OR＝2.201，95%CI：1.694～3.815，P＝0.028）；与C等位基因相比，G等位基因可显著增加HCC的发病风险（OR＝1.328，95%CI：1.039～1.654，P＝0.021）。与rs7574865位点TT基因型相比，GG型可显著增加HCC 的 发 病风 险（OR＝1.761，95%CI：1.027～3.020，P＝0.040）；与GT+TT基因型相比，GG型亦可显著增加HCC的发病风险（OR＝2.333，95%CI：1.209～4.503，P＝0.012）；与T等位基因相比，G等位基因可显著增加HCC的发病风险（OR＝1.409，95%CI：1.057～1.878，P＝0.019），见表3。

2.4分层分析本研究基于两组间一般资料比较结果，以吸烟、饮酒、HBV感染及HCC家族史进行分层分析显示，在饮酒人群中rs2293152位点GG基因型相比GC+CC基因型HCC发病风险显著升高（OR＝1.923，95%CI：1.241～3.562，P＝0.044），在HBV感染人群中rs2293152位点GG基因型相比GC+CC基因型HCC发病风险亦显著升高（OR＝2.216，95%CI：1.136～3.197，P＝0.031），见表4；在饮酒人群中rs7574865位点GG基因型相比GT+TT基因型HCC发病风险显著升高（OR＝1.234，95%CI：1.051～1.448，P＝0.010），在 HBV 感染人群中rs7574865位点GG基因型相比GT+TT基因型HCC发病风险亦显著升高（OR＝2.181，95%CI：1.122～4.243，P＝0.022），见表5。

表3 rs2293152、rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性关联分析Tab.3 The associations between SNPs of rs229315，rs7574865 and the hereditary susceptibility of HCC 例

2.5rs2293152、rs7574865位点SNPs与环境因素的交互作用分析经二分类Logistic回归模型分析rs2293152、rs7574865位点SNPs与环境因素的交互作用发现，rs2293152位点SNPs与饮酒（OR＝1.314，95%CI：1.125～1.649，P＝0.046）及 HBV 感染（OR＝3.102，95%CI：1.014～9.487，P＝0.027）间均存在正交互作用；rs7574865位点SNPs与饮酒（OR＝1.085，95%CI：1.017～1.158，P＝0.013）及HBV感染（OR＝4.778，95%CI：1.687～13.535，P＝0.003）间亦均存在正交互作用，见表6。

表4 rs2293152位点分层分析结果Tab.4 Results of rs2293152 stratification analyses 例（%）

表5 rs7574865位点分层分析结果Tab.5 Results of rs7574865 stratification analyses 例（%）

表6 rs2293152、rs7574865位点SNPs与环境因素的交互作用分析Tab.6 Results of gene-environment interaction analyses

3 讨论

STAT家族可将细胞外信号传递至细胞核内，发挥转录激活作用，其中STAT3、STAT4作为Janus激酶（JAK）/STAT信号通路中的关键转录激活因子，可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤新生血管生成，在HCC发生、发展及转移过程中均发挥重要作用［3-4］。个体遗传背景的差异亦与HCC发病密切相关，而SNPs能充分反映个体间的遗传差异，决定了个体对疾病的易感性，正成为研究HCC遗传易感性的重要工具，近年研究表明STAT3基因rs2293152位点和STAT4基因rs7574865位点SNPs与HCC发病风险存在一定的关联［5-6］。本研究采用病例对照研究方法，通过比较HCC患者与健康对照中rs2293152、rs7574865位点等位基因及基因型的差异，发现rs2293152位点G等位基因、GG基因型和rs7574865位点G等位基因、GG基因型均可显著增加HCC发病风险，与XIE等［8］和CHANTHRA等［11］研究结果相符，表明rs2293152、rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性明显相关。

HCC是由环境因素与遗传因素共同作用发展而来的复杂恶性疾病［12］，但饮酒、HBV感染等环境因素与rs2293152、rs7574865位点SNPs间的交互作用是否影响HCC的发病，目前尚未见相关的研究。饮酒与HCC的发生密切相关，一方面酒中的乙醇在肝脏中代谢所产生的中间产物乙醛会直接毒害肝细胞，另一方面乙醇可诱导微粒体乙醇氧化酶系的主要成分细胞色素P450E1活化外源性致癌物，使氧离子和过氧化氢等活性氧基团生成增多，氧化应激增强，导致肝损伤，加速肝纤维化进而诱发HCC［13］。本研究经分层分析发现，在饮酒人群中rs2293152位点GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位点GG基因型相比GT+TT基因型，HCC发病风险显著升高，并通过交互作用分析进一步指出rs2293152、rs7574865位点SNPs与饮酒的正交互作用，能够增加HCC发病风险。HBV感染是我国HCC最主要的危险因素，既可导致慢性乙型病毒性肝炎引起肝组织的炎症、纤维化及坏死等间接促进HCC发病，又能以HBV脱氧核糖核酸与肝细胞脱氧核糖核酸整合，使肝细胞基因发生突变，直接增加HCC发病风险［14-16］。本研究经分层分析发现，在HBV感染人群中rs2293152位点GG基因型相比GC+CC基因型，rs7574865位点GG基因型相比GT+TT基因型，HCC发病风险显著升高，并通过交互作用分析进一步指出rs2293152、rs7574865位点SNPs与HBV感染的正交互作用能够增加HCC发病风险。

综上所述，STAT3基因rs2293152位点和STAT4基因rs7574865位点SNPs与HCC遗传易感性明显相关，并与饮酒、HBV感染存在正交互作用，可增加HCC发病风险。因此，本研究可提供科学的理论依据指导HCC进行一级预防，对HCC高危人群开展rs2293152、rs7574865位点SNPs筛查，针对rs2293152位点G等位基因、rs7574865位点G等位基因携带者，建议戒酒、加强HBV感染防控，从而遏制HCC的发病。