肽基脯氨酰异构酶Pin1在动脉粥样硬化的血管平滑肌细胞衰老中的作用

张雪 吕磊 王鹏 袁凯 李茂然 张纪蔚 孟秋蓉 梁卫

1上海交通大学医学院附属仁济医院南院科（上海 201112）；2上海交通大学医学院附属仁济医院（上海200127）

细胞衰老限制了正常细胞的增殖，表现出一系列形态学和生理学上的改变，如细胞形态增大而扁平、酸性β-半乳糖苷酶活性增强以及基因表达模式改变［1-2］。动脉粥样硬化被认为是慢性炎症性疾病，许多潜在机制参与其中，众多证据表明血管细胞的衰老及凋亡在动脉粥样硬化中起重要作用［3-4］。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作为血管壁固有的最丰富的细胞，在动脉粥样硬化的病理进程中扮演主要角色［5-6］。

肽基脯氨酰异构酶（peptidyl-proplyl Isomerase，Pin1）是唯一能使特定的磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白肽键发生异构的酶，能诱导靶蛋白发生构像改变，代表了一种新的蛋白质功能调节信号传导机制。该机制被严格控制，只在某一范围内的生理及病理情况下发挥作用［7-8］。Pin1发挥分子计时器的功能，严格控制细胞周期进程及细胞分裂，进而调节细胞衰老［1，9］。研究表明，Pin1在阿尔茨海默病和许多癌症的发病机理中充当重要的调节因子［10］。本课题组研究揭示，Pin1在调节VSMCs增殖中发挥促进作用［11-12］，但其在VSMCs衰老中的作用还未被研究。有趣的是，在最近的研究中，本课题组在动脉粥样硬化的股动脉组织中观察到了Pin1表达水平的下调，同时伴有VSMCs衰老程度的增加。因此，本研究试图确定Pin1在人体动脉粥样硬化的VSMCs衰老中的作用。

1 材料与方法

1.1材料动脉粥样硬化的股动脉标本来自于6例2012年5月至2013年7月在上海仁济医院接受股腘动脉人工血管转流术的严重动脉粥样硬化患者（年龄53～83岁，平均年龄64岁）。正常股动脉标本来自5位捐献者（年龄42～78岁，平均年龄63岁），均在2012年5月至2014年6月期间因下肢严重创伤在上海仁济医院接受截肢手术。所有参与者皆签署了知情同意书。血管平滑肌细胞（VSMCs）由本实验室对股动脉组织进行原代培养所得［11］。上海仁济医院伦理委员会通过了此实验方案。

1.2试剂抗Pin1抗体、抗视网膜母细胞抗体（anti-pRb）、抗磷酸化视网膜母细胞抗体（anti-ppRb）、以及抗β-肌动蛋白抗体（英国Abcam公司），抗周期蛋白B抗体、抗周期蛋白E抗体（美国BD Pharmingen公司），抗周期蛋白D抗体（美国Santa Cruz公司），TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA试剂盒（德国Roche Applied Science公司），表达Pin1的腺病毒（Ad-Pin1）及对照的腺病毒（Ad-LacZ）（上海吉凯基因化学技术有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养从血管上轻柔地分离掉外膜和内膜细胞，将VSMCs用组织贴片法培养于DMEM完全培养基（内含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，置于37℃、5.0%CO2的培养箱中。VSMCs由平滑肌细胞a-肌动蛋白免疫染色验证。在所有实验之前，细胞在DMEM培养基中经过24 h的血清饥饿处理。

1.3.2运用免疫组化技术检测人体动脉粥样硬化病变的股动脉组织中Pin1的表达将股动脉组织在多聚甲醛中贮存24 h，随后放入乙醇中贮藏直到石蜡包埋。免疫组化技术的应用如前所述［13］。非特异性染色检测相应IgG的阴性对照组。

1.3.3利用改良的TRAP法分别检测正常及动脉粥样硬化的股动脉组织中VSMCs的衰老情况运用光度酶免疫分析法结合端粒扩增法来检测细胞端粒酶活性。分离的细胞当量为1×103，均通过TeloTAGGGTelomerase PCR ELISA试剂盒来检测端粒酶活性，详细步骤见说明书。

1.3.4运用蛋白质印迹分析法检测VSMCs和过表达Pin1的人体动脉粥样硬化的VSMCs中pRb通路以及cyclin通路关键蛋白的表达如前所述，VSMCs分为对照组（Ad-LacZ）和过表达Pin1组（Ad-Pin1），在无血清的DMEM培养基中进行6 h的腺病毒转导［14］。蛋白质印迹实验根据前述的标准方案来实施［11］。β-肌动蛋白作为内参。

1.4统计学方法计量资料以形式表示。运用D′Agostino和Pearson多项性检验对正态分布进行了检验。如果值呈正态分布，那么对两组间差异进行Student′st检验求得未配对均值，两组以上的差值进行方差分析后进行Bonferroni′s多重比较分析检验。如果结果不服从正态分布，那么差异将分别由Mann-Whitney或Kruskall-Wallis检验以及Dunn′s事后分析来进行比较。以P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1人体动脉粥样硬化病变的股动脉组织中Pin1表达下调与对照组血管（正常股动脉）相比，人动脉粥样硬化股动脉组织（n=10）中Pin1蛋白表达水平（图1，×100倍）明显下调（P＜0.05），组间的患者数据没有差别，这些数据包括年龄、性别、高血压或糖尿病患者比例、吸烟患者比例以及最近三个月内服用他汀类药物患者比例。

2.2动脉粥样硬化的VSMCs衰老增加与正常VSMCs相比，动脉粥样硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制（P＜0.05）（图2）。

2.3Pin1抑制VSMCs衰老和pRb磷酸化与正常VSMCs相比，动脉粥样硬化的VSMCs中p-pRb的表达水平显著增加（P＜0.05）；与对照组（Ad-LacZ）相比，过表达Pin1组（Ad-Pin1）人动脉粥样硬化的VSMCs中p-pRb的表达水平显著下降（P＜0.05），这提示Pin1通过抑制pRb磷酸化来防止VSMCs衰老。

图1 免疫组化检测人正常和动脉粥样硬化的股动脉组织中Pin1的表达Fig.1 Detection of Pin1 level in normal and atherosclerotic femoral artery by immunohistochemistry

图2 改良的TRAP法检测体外Pin1对VSMCs衰老的影响Fig.2 Detecting the effect of Pin1 on the senescence of VSMCs in vitro using a modified TRAP assay

2.4Pin1调节VSMCs衰老以及改变不同细胞周期蛋白的表达与正常VSMCs相比，动脉粥样硬化的VSMCs中细胞周期蛋白B、D和E表达水平明显下调（P＜0.05）；与对照组（Ad-LacZ）相比，过表达Pin1组（Ad-Pin1）人动脉粥样硬化的VSMCs中细胞周期蛋白B、D和E表达水平显著增加（P＜0.05）。

图4 蛋白质印迹分析法检测VSMCs中细胞周期蛋白B、D和E的表达Fig.4 Detection of Cyclin B，D and E levels in VSMCs by Western blot

3 讨论

根据目前的研究，Pin1表达水平的下调很可能是促进VSMCs衰老及动脉粥样硬化的一个因素。本研究阐述了人体动脉粥样硬化VSMCs中Pin1表达的下调及其与VSMCs衰老的关系。本课题组实验数据显示，相比于正常情况，动脉粥样硬化的股动脉组织中Pin1蛋白表达水平明显下调，同时动脉粥样硬化的VSMCs端粒酶活性被抑制。为了进一步探究Pin1抑制VSMCs衰老的机制，本研究检测了VSMCs中一些重要的衰老调节因子。结果表明，动脉粥样硬化的VSMCs中，p-pRb的蛋白水平明显增加。相反，在动脉粥样硬化的VSMCs中过表达Pin1导致p-pRb的蛋白水平显著下降，同时VSMCs衰老程度降低。笔者还发现，相比正常VSMCs，动脉粥样硬化的VSMCs中细胞周期蛋白B、D和E表达明显下调，反之当Pin1过表达时，细胞周期蛋白B、D和E上调，表明Pin1可能通过调控cyclin通路参与调节VSMCs的衰老。然而，在VSMCs中细胞周期蛋白B、D和E的表达具体如何被Pin1调控仍然有待进一步研究。本研究表明，Pin1可能通过影响p-pRb通路以及cyclin通路来调控VSMCs衰老，为研究Pin1和动脉粥样硬化之间的潜在机制提供了新的视角。

Pin1在细胞衰老的过程中发挥重要作用。TOKO等［15］证实，缺失Pin1会导致细胞周期停止，促进细胞衰老，同时Pin1过表达能促进心祖细胞分化并抑制其衰老。WHEATON等［16］报道，晚期人成纤维细胞中Pin1表达水平受抑制，促进细胞衰老，而Pin1异常高表达阻止了BTG2介导的细胞衰老。但是，Pin1在VSMCs衰老中的作用还没有被证实。动脉粥样硬化股动脉组织中Pin1表达水平的上调支持笔者关于Pin1促进VSMCs衰老的假设。

为了探求Pin1抑制VSMCs衰老的机制，本课题组检测了Pin1对一些介导细胞衰老的关键因子的影响。研究表明，pRb是Pin1作用的靶点［17］。Pin1通过改变pRb的亲和力而改变了周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的活性。pRb在G0到G1/S的过渡阶段逐渐被CDKs磷酸化。基于CDKs增强Pin1-pRb联系的证据，Pin1对于pRb通过CDKs进行磷酸化的完整过程是必需的［18］。CDKs和细胞周期蛋白在磷酸化过程中是主要参与者，而Pin1是协调这一过程的关键蛋白［17］。本课题组研究发现，在动脉粥样硬化的VSMCs中伴随着Pin1表达的下调，pRb磷酸化水平均增高，细胞周期蛋白B、D和E的表达水平下降。在动脉粥样硬化的VSMCs中，过表达Pin1可抑制pRb磷酸化，细胞周期蛋白B、D和E的表达水平上升。所有的结果表明，Pin1通过活化pRb通路和cyclin通路来调节VSMCs衰老，并且在动脉粥样硬化的发生发展中扮演重要角色。当然，调控VSMCs衰老的信号级联反应的具体作用机制将是一个值得进一步探索的新研究方向。

综上所述，VSMCs的衰老或许对动脉粥样硬化的形成与发展有重要影响。因此，清晰地阐明VSMCs的衰老在动脉粥样硬化中的具体作用机制很重要。当前研究结果表明，Pin1是VSMCs衰老调节机制中的关键因子，不仅拓宽了我们对于Pin1促进VSMCs衰老的认识，也为探索其具体分子机制提供了新的视角。因此，以Pin1为靶点的干预治疗或许是缓解与VSMCs衰老有紧密关联的动脉粥样硬化的新途径。